鸵鸟血液中性粒细胞中抗菌肽的分离纯化及其抗菌抗病毒作用的研究

论文摘要

收集鸵鸟新鲜抗凝血,应用0.83%氯化按溶液裂解至染色镜检无红细胞,低温离心,收集白细胞沉淀。将白细胞沉淀超声波破碎至染色镜检无完整细胞,低温高速离心提取细胞颗粒。10%醋酸溶液4℃下搅拌萃取抗菌肽,低温高速离心收集上清液,真空冷冻干燥,用0.01%醋酸溶液溶解即为抗菌肽粗提物。应用离子交换层析法将抗菌肽粗提物初步分离成两部分即阴离子组分和阳离子组分。将阳离子组分用RP-HPLC法进行分离获得有抗菌活性的目的蛋白。应用SDS-PAGE凝胶电泳方法检测目的蛋白的纯度,并初步测定其分子量,结果表明,抗菌活性产物分子量在4,700-4,980Da之间。粗提物抑菌试验结果表明,在鸵鸟中性粒细胞中存在天然抗菌物质,并表现出对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）、大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和真菌（白色念珠菌）较强的抑制作用。离子交换层析产物的抑菌试验结果表明,鸵鸟中性粒细胞中的抗菌物质是阳离子性质;主要作用于细菌,尤其是对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）,白色念珠菌（真菌）的抑制作用较大肠杆菌（革兰氏阴性菌）强。RP-HPLC纯化后抑菌试验结果表明,从得到的鸵鸟中性粒细胞抗菌肽显示出较强的抑菌活性。本试验采用鸡胚接种的方法观察了鸵鸟中性粒细胞抗菌肽对新城疫病毒以及鸡传染性支气管炎病毒的灭活作用。将NDV与IBV与抗菌肽以不同的方法混合作用于10日龄的鸡胚,测定鸡胚尿囊液中NDV血凝效价,并观察鸡胚病变。结果发现,与攻毒组比较,鸵鸟中性粒细胞抗菌肽使鸡胚尿囊液中NDV血凝效价降低,同时还能抑制因上述两种病毒所引起的鸡胚病变。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 抗菌肽的研究进展
• 1.1.1 抗菌肽的来源
• 1.1.2 抗菌肽的类型
• 1.1.2.1 杀菌肽（cecropins）
• 1.1.2.2 防御素（defensins）
• 1.1.2.3 蛙皮素——富含脯氨酸的抗菌肽（ proline－rich peptides）
• 1.1.2.4 蜂毒素——富含甘氨酸的抗菌肽（glycine－rich peptides）
• 1.2 禽类β-防御素的研究进展
• 1.2.1 禽类β-防御素的分类
• 1.2.2 禽类β-防御素的分子结构
• 1.2.3 禽类β-防御素的抗菌作用
• 1.2.4 禽类β-防御素的研究现状
• 1.3 抗菌肽的生物活性及作用机制
• 1.3.1 抗菌肽的抗菌功能及其作用机理
• 1.3.2.抗病毒功能及其作用机理
• 1.3.3 对肿瘤细胞的作用
• 1.3.4.对真菌的作用
• 1.4 抗菌肽的应用前景
• 1.4.1 抗菌肽的药用开发与应用前景
• 1.4.2 抗菌肽在动植物转基因工程中的应用
• 1.4.3 抗菌肽在畜牧生产上的应用
• 2 引言
• 3 鸵鸟中性粒细胞中抗菌肽的分离纯化和鉴定的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 实验动物
• 3.1.1.2 供试菌种
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂及配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 鸵鸟血液中中性粒细胞的获得
• 3.2.2 细胞染色
• 3.2.3 中性粒细胞抗菌肽粗提物的提取
• 3.2.4 阳离子交换层析
• 3.2.5 紫外吸收光谱
• 3.2.6 RP-HPLC 纯化
• 3.2.7 微量琼脂糖弥散法测定鸵鸟抗菌肽的抗菌活性
• 3.2.8 应用 SDS-PAGE 电泳显示小分子多肽
• 3.2.9 蛋白质含量测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 鸵鸟血液中性粒细胞抗菌肽的获得
• 3.3.2 鸵鸟血液中性粒细胞抗菌肽粗提物抑菌作用测定结果
• 3.3.3 离子交换层析与抑菌作用的测定结果
• 3.3.4 紫外吸收光谱
• 3.3.5 鸵鸟血液中性粒细胞抗菌肽离子交换层析活性峰 RP-HPLC 分离结果
• 3.3.6 抗菌肽分子量测定
• 3.3.7 蛋白质标准曲线的绘制
• 3.4 讨论
• 4 鸵鸟中性粒细胞中抗菌肽抗病毒作用的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 抗菌肽
• 4.1.1.2 病毒
• 4.1.1.3 SPF 鸡胚
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 鸡胚接种试验
• 50)的测定'>4.2.1 病毒毒力(EID₅₀)的测定
• 4.2.2 抗菌肽的毒性测定
• 4.2.3 鸵鸟中性粒细胞抗菌肽对病毒的抑制作用
• 4.3 结果与分析
• 50)的测定结果'>4.3.1 病毒毒力(EID₅₀)的测定结果
• 4.3.2 抗菌肽的毒性试验
• 4.3.3 鸡胚的病理变化
• 4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• ABSTRACT