论文摘要
木本植物在开花前要经历很长的童期生长,这极大地限制了木本植物尤其是经济类果树的育种效率和经济效益。柑橘是世界第一大果树,也是我国南方重要的经济树种。和其它木本植物一样,柑橘也存在较长的童期。因此,如何缩短果树的童期,是果树分子生物学的一个热点和难点。1976年,在我国湖北宜昌发现了一棵野生枳壳的早花变异株早实枳（precocious trifoliata orange）,与普通枳相比,具有童期短、开花早甚至一年内多次开花的现象。早实枳短童期的特性为研究柑橘成花调控的分子机理提供了宝贵的材料。FLC是植物春化调控途径中的关键基因,并且在其它调控途径中也起着十分重要的作用。本研究首先通过实时定量分析了早实枳中几个开花相关基因在不同处理条件下的表达情况,其次在本实验室前期的研究基础上,分离克隆PtFLC的启动子,并分析PtFLC不同转录本及其启动子的功能。主要研究结果如下：1.通过光周期、GA3和温度处理后,研究早实枳开花相关基因PtFLC、PtSVP、PtFT、PtLFY和PtAP1的表达情况。实时定量PCR结果显示,作为开花抑制因子,PtFLC和PtSVP的表达模式有很大不同。其中,PtFLC在长日照、GA3和低温处理条件下,表达量下降,而在短日照条件下略有上升,这一结果基本符合前人报道；而PtSVP在GA3和低温处理下表达量上升,而在短日照条件下则下降,推测可能是因为PtSVP与维持植物营养生长和自剪有关。作为开花促进基因,PtFT, PtLFY和PtAP1表达趋势大体一致。其中,在低温条件下,PtFT、PtLFY和PtAP1表达量明显上升,短日照条件下,PtFT、PtLFY和PtAP1表达量均下降,这一结果符合前人报道。在GA3处理下PtLFY和PtAP1表达也呈下降趋势,推测可能是因为本文所选GA3浓度不合理所致。2.通过两轮染色体步移技术分离得到PtFLC的上游片段1100bp。通过生物信息学分析发现,该段序列具有启动子特有的功能元件,同时还具有应答光周期、低温和GA3等外界环境条件的元件,此外还包含一些有关干旱胁迫的元件。因此,可以初步确定该段序列即为PtFLC的启动子序列。3.构建PtFLC启动子表达载体,连接报告基因,花序侵染法转化拟南芥,T0代种子播种,经抗性筛选及PCR鉴定,得到24棵阳性植株。但这些阳性植株GUS染色不成功。4.将本实验室已构建好的PtFLC不同转录本的表达载体转化拟南芥,得到转基因植株。观察并统计T2代植株的表型和开花情况。结果显示T2代植株表型基本正常,PtFLC不同转录本大部分可使开花推迟,其中PtFLC-4晚花最为明显。这一结果表明,PtFLC主要参与植物的开花调控,不同转录本由于包含外显子不同,使其抑制开花的能力存在差异。