飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因克隆及特性研究

论文摘要

谷胱甘肽硫转移酶在生物体内广泛存在,在化学杀虫剂的解毒代谢过程中发挥主要的作用。飞蝗是主要的农业害虫之一,对我国的农业生产为害较大。近年来,随着气候的变化及生态环境的破坏,蝗虫为害日益严重,并且随着化学杀虫剂的滥用导致蝗虫对杀虫剂的敏感性降低。为了能更有效地治理蝗虫,本文以飞蝗为材料,对谷胱甘肽硫转移酶在分子和蛋白水平进行系统的研究。主要内容如下：一、飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因克隆从飞蝗EST数据库中获得10个飞蝗GSTs序列片段,在NCBI数据库中经BLASTX比对确认,通过RACE-PCR技术获得10个飞蝗谷胱甘肽硫转移酶cDNA全长序列。经过氨基酸序列比对和系统进化聚类分析9个GSTs属于三个家族细胞质GSTs,其中1个属于delta家族（LmGSTd1）,7个属于sigma家族（LmGSTs1, LmGSTs2, LmGSTs3, LmGSTs4, LmGSTs5, LmGSTs6和LmGSTs7）,1个属于theta家族（LmGSt1）。剩余的1个GST与已知家族昆虫GSTs有较低的相关性,归为unclassified家族（LmGSTu1）。二、飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因分子特性研究采用RT-PCR方法,检测谷胱甘肽硫转移酶基因在飞蝗卵、1龄到成虫不同发育阶段的表达情况。结果发现LmGSTs1, LmGSTs4, LmGSTs6和LmGSTs1四个基因在卵阶段mRNA的表达量较低,LmGSTu1在卵期未见表达。LmGSTd1, LmGSTs1, LmGSTs3, LmGSTs5和LmGSTt1在飞蝗各个发育阶段表达情况没有明显变化。采用RT-PCR方法,检测谷胱甘肽硫转移酶基因在飞蝗前肠、中肠、胃盲囊、后肠、马氏管、脂肪体、肌肉、精巢和卵巢9个不同组织部位的表达情况。结果发现LmGSTd1, LmGSTs1, LmGSTs3, LmGSTs5, LmGSTs6和LmGSTt1 6个基因在所有组织中都表达。LmGSTs2, LmGSTs4, LmGSTs1和LmGSTu1在部分组织部位表达。Real-time PCR研究发现溴氰菊酯浓度在0.08μg/mL与0.12μg/mL时,飞蝗3龄蝗蝻的10个谷胱甘肽硫转移酶基因mRNA表达量增加。然而当溴氰菊酯浓度在0.16μg/mL或0.2μg/mL时LmGSTd1, LmGSTs1, LmGSTs5和LmGSTs6的mRNA表达量降低。溴氰菊酯处理后飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因mRNA表达量增加,可能会导致飞蝗对其它杀虫剂和异源物质的耐受力提高。三、飞蝗谷胱甘肽硫转移酶原核表达和蛋白特性研究在大肠杆菌中成功表达并经过纯化获得可溶性蛋白LmGSTt 1和LmGSTsl。LmGSTt1和LmGSTs1都能与CDNB （1-chloro-2,4-dinitrobenzene）和p-NBC （p-nitro-benzyl chloride）两种底物发生反应,其中CDNB是其最适底物。在40℃以下LmGSTt1和LmGSTs1都具有较好的稳定性。在GST的抑制剂ECA （ethacrynic acid）和RB （reactive blue）的浓度为0.05mM时,LmGSTt1的活性分别降至37±1%和6±0.1%。ECA对LmGSTt1的150值是12.6μM。RB对LmGSTtl的150值是4.41μM；LmGSTs1的活性分别降至81±3%和41±3%。RB对LmGSTs1的150值是18.5μM。毒死蜱、溴氰菊酯、马拉硫磷和西维因杀虫剂的浓度为0.05mM时,LmGSTt1的活性分别降至71±3%,88±2%,94±2%和83±1%,而LmGSTs1对上述农药则无显著影响。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 飞蝗概述
• 1.1.1 飞蝗分布、特征及生活习性
• 1.1.2 飞蝗的为害与防治
• 1.2 谷胱甘肽硫转移酶概述
• 1.2.1 谷胱甘肽硫转移酶的分类及命名
• 1.2.2 谷胱甘肽硫转移酶组织分布及发育期变化规律
• 1.2.3 谷胱甘肽硫转移酶的结构和功能
• 1.2.4 谷胱甘肽硫转移酶与昆虫抗药性的关系
• 1.3 研究内容及目的意义
• 第二章 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因克隆
• 2.1 研究材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 供试试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 序列来源及引物设计
• 2.2.2 总RNA的抽提、纯化和mRNA的分离
• 2.2.2.1 RNA的抽提
• 2.2.2.2 RNA的纯化
• 2.2.2.3 mRNA的分离
• 2.2.3 LmGST基因5'末端cDNA和3'末端cDNA序列的扩增
• 2.2.4 RACE PCR扩增产物的回收纯化
• 2.2.5 LmGST cDNA基因的克隆和测序
• 2.2.6 全长序列的验证
• 2.2.7 序列分析和聚类分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶cDNA全长序列的获得
• 2.3.2 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶的聚类分析
• 2.3.3 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶氨基酸序列的比对及分析
• 2.4 讨论
• 第三章 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶分子特性研究
• 3.1 研究材料
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 供试试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因在不同发育阶段的表达
• 3.2.1.1 实验材料的准备
• 3.2.1.2 总RNA的抽提、纯化和合成cDNA第一链
• 3.2.1.3 LmGST在不同发育阶段的表达
• 3.2.2 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因在不同组织部位的表达
• 3.2.2.1 实验材料的准备
• 3.2.2.2 总RNA的抽提、纯化和合成cDNA第一链
• 3.2.2.3 LmGST在不同组织部位的表达
• 3.2.3 溴氰菊酯对飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因表达的影响
• 3.2.3.1 实验材料的准镉
• 3.2.3.2 总RNA的抽提、纯化和合成cDNA第一链
• 3.2.3.3 溴氰菊酯对LmGST表达的影响
• 3.2.3.4 统计学分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 谷胱甘肽硫转移酶基因在飞蝗不同发育阶段的表达分析
• 3.3.2 谷胱甘肽硫转移酶基因在飞蝗不同组织部位的表达分析
• 3.3.3 溴氰菊酯对飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因表达的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因原核表达及特性分析
• 4.1 研究材料
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 供试试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 研究方法
• 4.2.1 重组质粒的构建
• 4.2.2 重组蛋白的诱导表达
• 4.2.3 重组蛋白的纯化
• 4.2.4 LmGST活性及蛋白含量的测定
• 4.2.5 重组蛋白LmGST特性研究
• 4.2.5.1 温度及pH对重组蛋白LmGST的影响
• max和K_m的测定'>4.2.5.2 重组蛋白LmGST动力学参数V_max和K_m的测定
• 4.2.6 抑制剂和杀虫剂对重组蛋白LmGST的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 LmGST的表达及纯化
• 4.3.2 LmGST的特性分析
• 4.3.3 抑制剂和杀虫剂对LmGST的影响
• 4.4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式