论文摘要
第一部分基因修饰的脐带间充质干细胞介导人凝血因子IX的体内外表达研究背景及目的:血友病B是一种由于凝血因子IX（FIX）缺乏而导致的严重出血性疾病,为X染色体连锁隐性遗传。缺乏FIX的病人内源性的凝血通路阻断,导致了终生自发性的出血和外伤、手术后出血的延长。传统的治疗是基于静脉内输入血浆来源的或重组的凝血因子蛋白。因为频繁的因子输入所需巨大的费用,故很少输入因子来预防出血。结果反复发生关节的损害,致命的出血风险仍然存在。遗传性疾病的基因治疗目的就是使丢失或缺陷基因得到长期和持续的表达。血友病B基因治疗通常将一野生型或最低限度地修饰的FIX转移入体内细胞中,这样有生物活性的FIX能分泌入血液。使用的基因递送系统必须是高效、安全、无免疫原性和能保证长期有效的基因表达。脐带间充质干细胞（HUCMSCs）具有高的增殖、分化能力和低的免疫原性,因而成为遗传性疾病（包括血友病B）体外基因治疗的迷人靶细胞。在本研究中,我们在HUCMSCs中表达人凝血因子IX,然后移植到小鼠体内来观察持续的FIX的分泌方法:构建含人凝血因子IX cDNA和部分外显子1序列的逆转录病毒载体,并使用它来包装逆转录病毒,病毒上清感染靶细胞HUCMSCs后G418筛选10天。使用western Blot来证实转导后的HUCMSCs培养上清有分泌型的hFIX。并用ELISA来测定上清的hFIX含量,使用人因子IX缺乏的血浆做凝集测定实验来测定上清hFIX的活性。将转导hFIX的HUCMSCs皮下移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠。鼠内眦采血后,ELISA测定血清中hFIX的水平。结果:转导后的细胞体外产生生理活性的hFIX。以正常人的血清hFIX的活性（100%）为参照,凝集测定实验证实了G418药物筛选10天后的培养上清（两天）的hFIX活性为100-130%和表达水平为2.68±0.36μg/106 cells/24 h。western blot实验证实了hFIX转导的HUCMSCs分泌hFIX入培养上清,而转导空载体的HUCMSCs上清没有hFIX分泌。hFIX转导的HUCMSCs（6×106细胞/鼠）皮下移植入免疫缺陷鼠中。移植一周后,鼠血清样本中hFIX水平达108.4ng/ml,一个月后下降到80.7ng/ml,两个月时仍达38.1 ng/ml。结论:我们的研究证实了hFIX基因修饰的HUCMSCs能从体内异位移植点连续分泌生理活性的hFIX,这样HUCMSCs能在血友病B的体细胞基因治疗中担当有效产生FIX基因药物的递送载体。第二部分RNA干扰沉默Bmi-1后对K562细胞功能的影响研究背景及目的:Bmi-1是一种转录抑制子,属于Polycomb家族成员之一,Polycomb家族具有长期的基因沉寂功能。Bmi-1的靶基因被普遍认为是INK4a基因座,它编码了p16INK4a和p19ARF肿瘤抑制蛋白。Bmi-1的过表达显著抑制了INK4a的表达。已证明Bmi-1的过表达发生在各种肿瘤中,包括一些类型的白血病。Bmi-1基因在调控正常或白血病干细胞的自我更新中起着至关重要的作用。缺乏Bmi-1的表达的白血病细胞遭遇了增殖阻止和表现了分化和凋亡的征兆,这些发现导致有人提议认为Bmi-1在癌症治疗干预中可作为潜在靶点。本课题研究靶向针对Bmi-1的短发夹RNA（shRNA）对人慢性髓性白血病K562细胞功能的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建靶向针对Bmi-1的shRNA真核表达载体,利用脂质体lipofactamine 2000将shRNA真核表达载体转染入k562细胞中,经G418（400μg/ml）筛选得到抗性克隆,通过PCR和western blot分别检测转染shRNA后k562细胞中Bmi-4的mRNA和蛋白水平的变化。MTT法检测干扰组、对照组和未转染组细胞间的增殖情况。克隆形成实验测定三组间克隆形成能力,流式细胞仪检测RNA干扰Bmi-1后,k562细胞周期的变化。结果:在设计的四个shRNA片段中,有一个片段有显著的抑制效果,该shRNA转染k562细胞后,在mRNA水平上Bmi-1的表达明显下调,Western blot在蛋白水平上也证实了Bmi-1表达显著下调。MTT法和克隆形成实验显示了干扰组、对照组和未转染组细胞三者间的增殖能力没有显著差异。干扰前后的细胞周期也没有明显改变。结论:抑制Bmi-1的表达并不能减少k562细胞的增殖,这提示了可能存在其它一些平行的信号通路在细胞转化中起重要作用,而且可能独立于Bmi-1的过表达。Bmi-1在慢性髓系白血病的转化中起着次要的作用。第三部分中国ITP病人IFN-γ+874A/T和IL-4 VNTR基因多态性研究目的:特发性血小板减少性紫癜（ITP）是一类与异常自身免疫反应及自身血小板抗体产生有关的疾病,患者体内的抗血小板抗体结合血小板,导致网状内皮系统对后者的捕获和清除。T1/T2的T1极化促成特发性血小板减少性紫癜的发生。细胞因子在ITP的发病机制中起关键的作用。本研究的目的是调查IFN-γ+874A/T、和IL-4内含子3可变数量串联重复（VNTR）的多态性是否部分参与了ITP的基因易感性。方法:分别使用PCR-SSP和直接PCR在196位病人和128位健康个体中对IFN-γ+874A/T和IL-4内含子3 VNTR进行了基因定型。结果:当所有病人作为一个整体来分析时,IFN-γ+874A/T和IL-4内含子3 VNTR基因多态性和ITP的风险没有相关性。把病人进一步细分为两组:儿童ITP和成人ITP。在这两组利对照组中,这两个基因多态性的基因型和等位基因频率没有统计学意义。把病人进一步细分为四组:急性儿童ITP,慢性儿童ITP,急性成人ITP,慢性成人ITP。在这四组与对照组比较中可观察到相似的结果。结论:这些基因多态性在ITP病人和对照个体中有相似的分布。这表明了这两候选的基因多态性可能没有参与ITP的易感性。
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