论文摘要
目的采用Langendorff离体大鼠心脏灌注模型,观察七氟烷缺血后处理（IPO）对大鼠心肌的保护作用,研究七氟烷IPO信号转导通路中蛋白激酶B（PKB/Akt）-糖原合成激酶3β（GSK3β）对线粒体通透性转换孔（mPTP）和线粒体钾离子敏感性三磷酸腺苷通道(mKATP通道)影响,探讨mKATP通道和mPTP作用的相关性。方法120只雄性Wistar大鼠,体重270g～325g,随机分为8组,每组15只。8组分别为:Control组（空白对照,不加任何干扰因素）、ISCH组（心肌缺血未行保护措施）、ISCH+ATR组（心肌缺血+苍术甙（ATR））、ISCH+5—HD组（心肌缺血+5-羟癸酸（5-HD））、Vehicle组（心肌缺血+溶剂二甲亚砜（DMSO））、IPO组（心肌缺血+七氟烷缺血后处理）、IPO+5-HD组（心肌缺血+七氟烷IPO+5—HD）、IPO+ATR（心肌缺血+七氟烷IPO+5—ATR）。2.5%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后,股静脉注射肝素1000 U/kg抗凝。开胸,取下心脏放入4℃改良Krebs-Henseleit（K—H）液中,主动脉插管悬挂心脏于Langendorff灌流装置上,用K—H缓冲液行主动脉逆行灌流（灌注压为10.67 kPa）。连接压力换能器至PowerLab多导生理监测仪,以Chart 5 forWindows软件实时观察并分析左室发展压（LVDP）、左心室压力上升变化最大速率(±dP/dtmax)、心率（HR）。记录平衡20 min、再灌注15 min和60 min冠脉流量,并保存心肌灌注流出液。K-H缓冲液灌注自主跳动的心脏20 min,以达到平衡的目的（baseline）,继之以停灌注40 min以达到实验性缺血（global ischemia）的目的。Control组未行其他处理,只是时间匹配。ISCH组全心缺血40min,未给其它干预措施。ISCH+ATR组再灌注伊始给予ATR 20μM/L,15 min后复灌45 min。ISCH+5HD组再灌注伊始给予5-HD 15μM/L,15 min后复灌45 min。Vehicle组全心缺血40 min后给予DMSO,15 min后复灌45 min。IPO组在复灌起始阶段,给予七氟烷1.0 MAC（2.0vol%）15 min行麻醉药缺血后处理。七氟烷通过Isotec 3麻醉气体蒸发罐（Datex-Ohmeda）平衡缓冲液。以Datex气体检测仪持续监测缓冲液中七氟烷浓度,以保证进入主动脉灌注液的七氟烷浓度维持在2.0%（vol/vol）（1.0 MAC,大鼠,37℃）。再灌注前10 min,将1.0 MAC七氟烷充入K-H液中,以饱和缓冲液。复灌15 min后更换无七氟烷K-H液续灌45 min。IPO+5-HD组和IPO+ATR组,为分别复合使用七氟烷+5-HD及复合使用七氟烷+ATR,方法同前。用2,3,5-氯三苯四唑（TTC）染色法确定心肌梗死区面积。用Image J 1.37行图像分析,砖红色为正常区域,灰白色为梗死区域。梗死面积由左室总坏死区占左室总切片区的百分数来界定。复灌60 min,取左心室组织石蜡包埋并切片,标本行TUNEL染色,计算凋亡指数（AI）。分别在心脏灌流平衡20 min,再灌注60 min收集心脏流出液并测定乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK—MB）和肌钙蛋白I（cTnI）的浓度。采用组织匀浆法分离心肌细胞胞浆和线粒体。采用蛋白印迹分析（Western Blot）法分析B淋巴细胞瘤/白血病—2（Bcl-2）、细胞色素C（Cyt C）的线粒体和胞浆含量、磷酸化蛋白激酶B（p-PKB/Akt）和PKB/Akt的比率以及磷酸化-糖原合成激酶3β（p-GSK3β）和GSK3β的比率。结果由血流动力学参数可知,各组基础值之间差异不显著。和基础值相比,缺血后的各组LVDP,±dp/dt,HR和CF均显著性下降（P＜0.05）。和对照组比,其它实验组的LVDP,±dp/dt,HR和CF均显著性下降（P＜0.05）。和七氟烷IPO组比,除对照组除外其它各组缺血后LVDP、±dp/dt、HR和CF均显著性下降（P＜0.05）。和对照组比,ISCH组、IPO组复灌后心脏灌注流出液的LDH、CK-MB和cTnI均显著升高（p＜0.05）;和ISCH组比,IPO组复灌后心脏灌注流出液的LDH、CK-MB和cTnI均显著降低（p＜0.05）。和基础值比,对照组K-H液灌流120 min的LDH、CK-MB和cTnI未发现显著变化（p＞0.05）,ISCH和IPO组复灌60 min的LDH、CK-MB和cTnI均显著升高（p＜0.05）。Control组TTC染色未见明显的梗死区。与ISCH组比,各实验组的TTC染色显示的梗死区占左室总面积的百分数显著升高（P＜0.05）。和ISCH比,Control组、IPO组和IPO+5-HD组的AI显著降低（P＜0.05）;和Control组比,其它实验组的AI值均显著增高（P＜0.05）:和IPO比,除Control组外其它各组AI值显著升高（P＜0.05）。和Control组比,除Vehicle和IPO组外,其它各组Bcl-2值均显著性下降（P＜0.05）;和ISCH组比,Control、Vehicle和IPO组值显著上升（P＜0.05）;和IPO组比,除Control组外,其它各组均显著降低（P＜0.05）。和Control比,除IPO组外,其它各组线粒体中的Cyt C含量均显著性降低（P＜0.05）;和ISCH比,Control组、IPO组和IPO+5-HD组线粒体中的Cyt C含量均显著增高（P＜0.05）;和IPO比,Control组线粒体的Cyt C值显著增高（P＜0.05）,而其它各实验组线粒体中的Cyt C含量显著下降（P＜0.05）。和Control比,各试验组胞浆中Cyt C含量均显著性升高（P＜0.05）;和ISCH比,Control组、IPO组和IPO+5-HD组胞浆中的Cyt C含量均显著降低（P＜0.05）:和IPO比,Control组线粒体的Cyt C值显著降低（P＜0.05）,其它各实验组胞浆中的Cyt C含量显著上升（P＜0.05）。和Control组比,其它实验组的p-AKT/AKT比率显著增高（P＜0.05）;和ISCH组比,IPO组和IPO+5—HD组显著增高。与Control组比,其它各实验组的p-GSK3β/GSK3β比率显著升高（P＜0.05）;与ISCH组比,ISCH+ATR和IPO+ATR显著降低P＜0.05),而IPO和IPO+5-HD显著上升P＜0.05)。结论七氟烷缺血后处理对离体大鼠心肌有保护作用;七氟烷缺血后处理可减轻心肌细胞凋亡和坏死:PKB/Akt-GSK3β可能是七氟烷缺血后处理重要信号转导途径之一;七氟烷缺血后处理时,mKATP对调节mPTP的功能方面可能发挥着重要作用。
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