角蛋白降解菌Streptomyces fradiae var.k-11中蛋白酶基因的克隆及表达

论文题目: 角蛋白降解菌Streptomyces fradiae var.k-11中蛋白酶基因的克隆及表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 李江

导师: 范云六

关键词: 弗氏链霉菌,蛋白酶,角蛋白酶,基因克隆和表达

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 角蛋白(Keratin)是一种广泛存在于自然界中的硬性蛋白,主要存在于各种动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等结构中。角蛋白化学结构稳定,不溶于水,也不能被一般的蛋白酶,如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解。从微生物中纯化的角蛋白酶活性很强,可以水解多种难降解的纤维蛋白,如角蛋白、弹性蛋白和胶原等,具有广泛的应用前景。 本研究确定了角蛋白降解菌弗氏链霉菌k11(Streptomyces fradiae var.k11)有利于蛋白酶纯化的最佳产酶培养条件。通过蛋白酶的同工酶电泳,从角蛋白降解菌弗氏链霉菌k11的培养液上清中,发现了六种分泌的蛋白酶,初步摸清了弗氏链霉菌k11的分泌蛋白酶酶系。 通过RT-PCR,初步研究了弗氏链霉菌k11的六种蛋白酶基因在羽毛培养基和高氏1号培养基中,不同发育时期的表达情况。研究结果表明,所研究的几种分泌蛋白酶的表达均为组成型表达,与生长环境中是否存在角蛋白无关。 纯化了弗氏链霉菌k11所产的两种分泌蛋白酶,并进行了部分氨基酸序列测定。 构建了弗氏链霉菌k11的基因文库。利用多种基因克隆技术组合,克隆得到了六种蛋白酶基因sfp1,sfp2,sfp3,sfap,sfp4和sfp5(其中四个基因sfp1,sfp2,sfp3和sfap已在EMBL注册,注册号分别为AJ784159,AJ784940,AJ810091和AJ781828)。 在已克隆得到的六种分泌蛋白酶中,有三种(SFP1,SFP3,SFAP)与已报道的同源性最高的蛋白酶的DNA同源性在80%以下,氨基酸同源性在72%以下,是三种新发现的蛋白酶基因。 克隆的另一蛋白酶基因sfp2,其成熟蛋白的氨基酸序列与已报道的Sfase-2同源性高达99.5%,基本上可认为是同一蛋白酶,根据我们及前人的研究结果,这一蛋白酶具有较高的角蛋白酶活性,是一极具应用潜力的蛋白酶,但前人的工作只得到了成熟蛋白的部分基因序列(编码成熟蛋白的576bp中的492bp),蛋白酶的pro肽、信号肽编码序列及基因侧翼序列均未得到,而且未验证基因功能,而蛋白酶的pro肽对蛋白酶的活性表达具有重要作用。本研究从蛋白纯化出发,经蛋白测序,进而调出部分基因序列,通过构建基因文库,首次获得了包括信号肽、pro肽编码序列在内的完整的基因序列。 构建了组成型和蔗糖诱导型分泌表达的枯草芽孢杆菌表达系统,为今后开发利用上述基因建立了初步的表达技术平台。 在大肠杆菌BL21中表达了sfp2和sfp1基因,验证了基因的功能,证明克隆的sfp2和sfp1基因是蛋白酶基因,为今后对这些基因的开发利用打下了良好的基础。在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均表达了sfp2基因的成熟蛋白基因和蛋白酶原基因,证明蛋白酶的pro肽部分对蛋白酶的活性表达起着重要的作用。 测定了在大肠杆菌中表达的蛋白酶SFP2的部分酶学性质,发现SFP2对角蛋白具有较强的底物专一性,是一种具有较强角蛋白酶活性的蛋白酶。研究发现,还原剂的存在,能极大地提高其角蛋白酶活性。克隆和表达的SFP2具有较大的应用潜力。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

第一章 引言

1 研究目的和意义

2 国内外研究现状

2.1 产生角蛋白酶的微生物

2.1.1 真菌

2.1.2 放线菌

2.1.3 细菌

2.2 角蛋白酶的理化性质

2.2.1 底物特异性

2.2.2 分子量

2.2.3 最适pH值和最适温度

2.2.4 蛋白酶抑制剂和各种离子的作用

2.2.5 其它

2.3 角蛋白的酶解机理

2.3.1 变性作用

2.3.2 水解作用

2.3.3 转氨基作用

2.4 角蛋白酶的分子生物学研究进展

2.4.1 角蛋白酶表达调控的研究进展

2.4.2 角蛋白酶基因

2.4.3 角蛋白酶的晶体结构

2.4.4 角蛋白酶的基因工程

2.5 角蛋白酶的应用前景

2.5.1 饲料和饲料添加剂

2.5.2 农药

2.5.3 医药和化妆品

2.5.4 角蛋白酶与疯牛病

2.5.5 其它用途

2.6 问题与展望

2.6.1 目前存在的问题

2.6.2 展望和对策

3 研究内容和方法

3.1 研究内容及目标

3.2 研究方法

第二章 蛋白酶基因的克隆

1 材料与方法

1.1 实验材料和实验设备

1.1.1 菌株与质粒

1.1.2 引物合成

1.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂

1.1.4 溶液

1.1.5 培养基

1.1.6 实验仪器

1.2 实验方法

1.2.1 弗氏链霉菌k11(Streptomyces fradiae var. k11)对羽毛和头发的降解

1.2.2 弗氏链霉菌k11的诱导产酶

1.2.3 蛋白酶的纯化

1.2.4 蛋白酶的氨基酸序列测定

1.2.5 弗氏链霉菌k11总DNA的提取

1.2.6 蛋白酶基因部分序列的克隆

1.2.7 反向PCR

1.2.8 基因文库的构建和筛选

2 结果

2.1 弗氏链霉菌k11(Streptomyces fradiae var. k11)降解羽毛和头发

2.2 蛋白酶的纯化

2.3 蛋白酶的氨基酸序列测定结果

2.4 蛋白酶部分编码基因序列的克隆

2.4.1 丝氨酸蛋白酶SFP2部分编码基因序列的克隆

2.4.2 氨肽酶SFAP部分编码基因序列的克隆

2.4.3 SFP4部分编码基因序列的克隆

2.4.4 SFP5部分编码基因序列的克隆

2.4.5 SFP1部分编码基因序列的克隆

2.4.6 SFP3部分编码基因序列的克隆

2.5 反向PCR结果

2.6 基因文库的构建和筛选

2.7 六种蛋白酶基因的DNA序列

2.7.1 sfp2

2.7.2 sfap

2.7.3 sfp1

2.7.4 sfp3

2.7.5 sfp5

2.7.6 sfp4

3 讨论

本章小结

第三章 弗氏链霉菌k11蛋白酶基因的表达研究

1.材料与方法

1 .1实验材料

1.1.1 菌株

1.1.2 引物合成

1.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂

1.1.4 培养基

1.1.5 实验仪器

1.2 实验方法

1.2.1 取样

1.2.2 细胞总RNA的提取

1.2.3 甲醛变性电泳

1.2.4 反转录合成cDNA第一条链

1.2.5 第一轮PCR扩增

1.2.6 第二轮PCR(nested PCR)

2.结果

2.1 第一轮PCR反应结果

2.2 第二轮PCR反应(nested PCR)结果

3.讨论

本章小结

第四章 蛋白酶基因的异源表达

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与质粒

1.1.2 引物合成

1.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂

1.1.4 培养基

1.2 实验方法

1.2.1 枯草芽孢杆菌表达载体的构建

1.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和电击转化

1.2.3 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和电击转化

1.2.4 丝氨酸蛋白酶SFP2的表达及检测

1.2.5 丝氨酸蛋白酶SFP1的表达及检测

1.2.6 氨肽酶SFAP的表达及检测

2.结果

2.1 枯草芽孢杆菌穿梭表达载体的构建

2.1.1 组成型分泌表达穿梭载体pHY500A的构建

2.1.2 蔗糖诱导分泌型穿梭表达载体pHY500S的构建

2.2 丝氨酸蛋白酶SFP2的表达及检测

2.2.1 在大肠杆菌中的表达

2.2.2 在枯草芽孢杆菌中的表达

2.3 蛋白酶SFP1的表达及检测

2.3.1 重组表达载体pET-22b-sfp1pro的构建

2.3.2 SFP1的诱导表达

2.4 氨肽酶SFAP的表达及检测

2.4.1 重组表达载体pET-22b-sfap1、pET-22b-sfap2、pET-22b-sfapm1及pET-22b-sfapm2的构建

2.4.2 SFAP的诱导表达

3.讨论

本章小结

第五章 蛋白酶SFP2的酶学性质

1.材料与方法

1.1 实验材料和实验设备

1.1.1 菌株

1.1.2 酶、底物和生化试剂

1.1.3 培养基

1.1.4 实验仪器

1.2 实验方法

1.2.1 SFP2的表达和初步纯化

1.2.2 蛋白酶活性测定方法

1.2.3 以酪蛋白为底物测定SFP2的部分酶学性质

1.2.4 以天青角蛋白为底物测定SFP2的部分酶学性质

2.结果

2.1 以酪蛋白为底物测定SFP2的部分酶学性质

2.1.1 SFP2的最适pH值

2.1.2 SFP2的最适反应温度

2.2 以天青角蛋白为底物测定SFP2的部分酶学性质

2.2.1 SFP2最适pH值和pH稳定性的测定

2.2.2 SFP2最适反应温度和热稳定性的测定

2.2.3 抑制剂对SFP2活性的影响

2.2.4 SFP2与胰蛋白酶、蛋白酶K比较

3 讨论

本章小结

第六章 结论

参考文献

致谢

作者简历

发布时间: 2005-09-05

参考文献

• [1].不同倍性鱼HPG轴生殖基因的表达及性别决定的机制研究[D]. 王道.湖南师范大学2013
• [2].三种养殖扇贝热休克蛋白HSP70在逆境因子下的表达和相关基因的克隆[D]. 曲凌云.中国科学院研究生院（海洋研究所）2004
• [3].文昌鱼分子生物学：AmphiSRP19、AmphiLysC与AmphiS19基因克隆、表达和进化研究[D]. 刘梅.中国海洋大学2004
• [4].人类激酶基因CK1γ1L2和PDIK1L的克隆和功能研究[D]. 郭凌晨.复旦大学2004
• [5].人类SCDR10B、LHFPL1和CYPJ基因的克隆及其编码蛋白的特征与功能研究[D]. 黄超群.复旦大学2004
• [6].灰飞虱免疫相关基因及微管蛋白基因的克隆和分子鉴定[D]. 温建国.复旦大学2004
• [7].HN1家族基因和PNO1基因的克隆和功能初步研究[D]. 周光金.复旦大学2004
• [8].费氏中华根瘤菌RT19与耐盐有关基因的克隆和功能研究[D]. 姜巨全.中国农业大学2005
• [9].睾丸特异蛋白激酶TSSK4的基因克隆及功能初探[D]. 陈秀娟.复旦大学2005
• [10].新型抗肿瘤转移多肽（β肽）的基因工程制备及其生物学效应[D]. 王松梅.复旦大学2005

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• [7].嗜热毛壳菌热稳定蛋白酶的纯化、基因克隆与表达[D]. 李安娜.山东农业大学2007
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