CE&HTS技术初步分析母子间外周血T细胞TRBV F&P基因家族CDR3组成和特征

论文摘要

目的(1)采用毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)基因扫描技术初步分析母与子志愿者外周血T细胞26个TRBV基因(TCR beta chain variable gene, TRBV)家族CDR3(complementarity determining regions 3, CDR3)长度和多态性分布。(2)选取其中部分TRBV功能性基因(Functional gene, F)和假基因(Pseudogene, P)家族CDR3进行克隆测序,分析CDR3区基因和氨基酸组成和特征。(3)选取部分TRBV功能性基因和假基因家族的CDR3进行高通量测序,分析CDR3受体库的组成和特征。方法(1)采集10例健康志愿者外周血样本,母与子(2例)、母与双胞胎儿子(3例)、非遗传关系样本(5例),提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的总RNA,逆转录cDNA。(2)设计并合成人TRBV基因家族26条特异性上游引物、一条共同的FAM标记下游TRBC(TCR beta chain constant gene, TRBC)引物；PCR扩增各样本中26个TRBV家族CDR3。(3)采用毛细管电泳基因扫描技术,分析7例样本中26个TRBV家族CDR3长度和多态性分布。(4)根据7例样本26个TRBV家族CDR3长度和多态性分布结果,选取其中5例样本的TRBV6家族CDR3和1例样本的TRBV10、TRBV19进行克隆测序,分析CDR3区基因和氨基酸组成特征。(5)选取6例样本的cDNA为研究对象,设计并合成6套带特殊标签的引物,采用HTS技术(Roche 454 GS FLX)测序6例样本中TRBV6、TRBV9、TRBV10、TRBV19家族CDR3受体库的组成和特征。结果(1)经毛细管电泳基因扫描分析,7例健康志愿者PBMC的TRBV CDR3谱系显示：同一个人不同家族CDR3长度和多态性表现不一致,不同人同一个家族CDR3长度和多态性表现不一致；26个TRBV家族CDR3的毛细管电泳基因扫描峰型图大部分表现为中间高两端低的“钟型”高斯分布；具有遗传关系的母子间的部分TRBV家族的CDR3长度和多态性表现相似；24个TRBV功能性基因家族CDR3区为相隔3bp的框架内重排,而TRBV10和TRBV19基因家族CDR3区为相隔1bp、2bp、3bp的框架内和框架外重排。(2) TRBV6家族CDR3的克隆测序结果显示：CDR3区为相隔3bp的基因组成；有遗传关系的母子样本间CDR3的TRBJ(TCR beta chain junction gene, TRBJ)端存在一些共同的基序,同时取用的TRBJ家族频率相近或相同。1例样本的TRBV10、TRBV19的克隆测序结果显示：CDR3区为相隔lbp、2bp、3bp的基因组成。(3)Roche 454 GS FLX高通量测序结果显示：遗传样本间(母与子、母与双胞胎儿子)TRBV6和TRBV9的CDR3基因/氨基酸组成的重叠率增加,大于非亲缘关系的样本；外周血样本中TRBV10、TRBV19家族总的CDR3序列显著少于TRBV6和TRBV9;同时每个样本的TRBV10、TRBV19非框架内重排CDR3数均高于框架内重排的CDR3数。结论(1)有遗传关系的母子(或双胞胎儿子)间外周血T细胞TRBV CDR3谱系的部分家族长度和多态性相似,CDR3区存在共同的基序和TRBJ家族取用频率相近或相同,454高通量测序结果显示遗传样本间CDR3重叠率高于非遗传样本。提示遗传样本间TCR beta链CDR3谱系存在一定相关性,为下一步研究遗传相关的自身免疫病等T细胞应答提供了基础。(2)从分析CDR3长度和多态性、CDR3受体库水平的基因组成时发现,人PBMC样本中,TRBV10和TRBV19基因家族以框架外重排为主,同时存在框架内重排。为进一步研究同时表现为假基因和功能性基因的TRBV家族提供了很好的数据、方法和手段。(3)本实验在国内率先开展CDR3受体库高通量测序的免疫学组学研究,建立的技术流程和数据分析平台,为开展T细胞生理和病理研究提供了新思路和强有力工具。

论文目录

• 英汉缩略词对照表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述:T细胞CDR3受体库的研究方法概况
• 参考文献
• 读研究生期间完成的其他主要科研工作
• 附图和附表
• 致谢
• 作者简介