论文摘要
NF-κB是一种十分重要的转录因子,参与多种基因的表达调控,具有影响细胞的生长、分化、凋亡、癌变和个体发育等多种生物学功能。它的异常激活与肿瘤的发生,抗药性和肿瘤的转移相关,而抑制细胞内NF-κB的异常激活就可抑制肿瘤的发生、转移,降低肿瘤细胞对化疗或放疗的耐受性。因此,NF-κB是一种新型抗肿瘤药物筛选的靶分子。 本实验从人神经胶质瘤U251细胞中提取总RNA,通过RT-PCR方法得到人NF-κB P50全长基因（长1308bp,编码436个氨基酸）;构建了重组表达载体pGEX-4T-P50;转入大肠杆菌后,在30℃,IPTG终浓度为0.2mM,诱导6hr,获得融合蛋白GST-P50（分子量约70kD）,表达量占菌体总蛋白的30%,可溶性融合蛋白为总融合蛋白的1/5;纯化融合蛋白并免疫家兔获得了多克隆抗体,抗体经纯化并分装保存;Western印迹分析表明纯化后的多克隆抗体中已经无针对GST蛋白的抗体,而只具有较强的专一于P50蛋白的抗体;ELISA分析证实其效价为5×105。 本实验构建的酶标检测方法,经过摸索并确定了:GST-P50包被浓度为1μg/ml、包被体积为100μl,抗体的稀释度为1/1600,抗体与核蛋白样品的温育条件为37℃ 1hr,此时检测NF-κB活性的灵敏度最高,可达到ng级,足以检测出细胞中NF-κB活性的微量变化。 进一步利用检测模型来验证此酶标方法的优劣,实验组加入了100ng/mlLPS刺激U251细胞30min,细胞中NF-κB的活性就显著增高,1hr达到峰值,然后开始下降,6hr已经处于低水平的维持状态;当刺激时间同样维持在1hr,LPS的浓度分别为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、100ng/ml时,细胞中NF-κB的活性随剂量的增加而增高,用我们的酶标方法得到的检测结果（细胞内NF-κB活性变化趋势）与Wang X的报道一致,从而验证了本实验所建立的酶标方法具有特异性和实效性。该酶标方法的建立为判定NF-κB的活化程度、研究相关信号转导及筛选高效的NF-κB拮抗药物奠定了基础。
论文目录
致谢目录摘要ABSTRACT第一部分第一章 文献综述1.1 NF-κB蛋白家族组成1.2 NF-κB的激活途径1.3 NF-κB调控的基因1.4 NF-κB的生物学功能1.4.1 NF-κB与细胞凋亡1.4.2 NF-κB与细胞周期1.4.3 NF-κB与免疫1.4.4 NF-κB与肿瘤1.5 NF-κB是一种新型抗肿瘤药物筛选的靶分子1.6 现有检测NF-κB活性的方法第二章 实验设计方案2.1 本实验的选题依据及目标2.2 本实验的主要内容2.3 本实验所要解决的关键性问题2.4 技术路线第二部分第三章 重组表达载体PGEX-4T-P50的构建3.1 材料3.1.1 实验材料3.1.2 培养基和缓冲液3.2 实验方法3.2.1 总RNA提取3.2.2 RT-PCR反应3.2.3 PCR扩增目的片段3.2.4 低熔点胶回收PCR产物3.2.5 重组载体pGEX-4T-P50的制备3.2.6 连接反应3.2.7 E.coli TG1感受态细胞的制备（以下操作均在超净台上进行）3.2.8 连接产物转化感受态细胞3.2.9 碱法小批量抽提质粒DNA3.2.10 重组质粒pGEX-4T-P50的双酶切鉴定3.2.11 重组质粒pGEX-4T-P50的PCR鉴定3.2.12 基因序列测定3.2.13 核酸电泳3.3 结果与分析3.3.1 总RNA的提取3.3.2 质粒pGEX-4T-1的图谱3.3.3 重组载体构建策略3.3.4 重组载体的鉴定3.4 讨论第四章 融合蛋白的诱导表达、纯化及抗体制备4.1 材料4.1.1 实验材料4.1.2 试剂和缓冲液4.2 实验方法4.2.1 融合蛋白的诱导表达4.2.2 融合蛋白的纯化4.2.3 抗体的制备4.2.4 抗体的纯化4.2.5 抗体的Western印迹分析（参照分子克隆实验指南）4.2.6 抗体的ELISA检测4.3 结果与分析4.3.1 SDS-PAGE分析融合蛋白的表达及纯化4.3.2 抗体的Western印迹分析4.3.3 抗体的ELISA检测分析4.4 讨论第五章 酶标检测方法的构建及验证5.1 材料5.1.1 实验材料5.1.2 培养基、试剂和缓冲液5.2 实验方法5.2.1 U251细胞培养5.2.2 U251细胞冻存5.2.3 细胞处理及分组5.2.4 核蛋白的提取5.2.5 检测模型验证5.2.6 统计学处理5.3 结果与分析5.3.1 酶标方法原理图5.3.2 酶标方法的建立5.3.3 检测模型对其验证5.4 讨论结论展望附录参考文献
相关论文文献
标签：人基因论文; 多克隆抗体论文; 活性检测论文;
