金鱼卵黄脂磷蛋白的分离纯化、性质鉴定及其多克隆抗血清的制备

论文摘要

近年来，环境雌激素对野生生物和人类产生的危害引起了人们的广泛关注。目前，鱼类卵黄原蛋白（Vitellogenin, Vtg）作为筛选环境雌激素的特异性生物标志物，已经得到广泛应用。研究表明，鱼类Vtg在纯化过程中易发生降解，且温度影响尤为显著，这对Vtg的检测与纯化制备十分不利。Vtg在卵巢中酶解成三种主要的卵黄蛋白，其中卵黄脂磷蛋白（Lipovitellin, Lv）和β’-组分（β’-component,β’-c）与Vtg具有相同的免疫原性。Lv因在鱼卵巢中含量丰富，稳定性较好，已被研究者制备多克隆抗血清，用于血浆Vtg的检测。本研究以金鱼卵巢组织作为实验材料，分离纯化出金鱼Lv，研究了其基本性质和热稳定性，制备了鼠抗金鱼Lv多克隆抗血清，分析了金鱼Vtg与Lv之间的免疫原性，并且利用Westernblot技术分析了金鱼Lv抗血清与鲤鱼、鲫鱼、斑马鱼、美国红鱼、石鲽等Vtg的免疫交叉反应。研究结果表明：将金鱼卵匀浆，经硫酸铵沉淀盐析，制备金鱼卵匀浆提取液，Native-PAGE显示，提取液中含有丰富的卵黄蛋白。经凝胶过滤和离子交换两步层析法进一步分离、纯化，得到纯的卵黄蛋白。分别利用苏丹黑、Schiff试剂和甲基绿进行染色，结果显示该蛋白是一种含有脂、糖、磷的蛋白；在非变性条件下其分子量约为385kDa，SDS变性电泳显示其单体分子量约为112kDa；氨基酸组成分析表明，金鱼Lv中Glu（12.28）、Ala（10.84%）、Val（10.37）、Leu（11.02%）、Asp（6.56%）的含量较高，这5种氨基酸总和占氨基酸总量的51.07%，His（2.53）和Met（2.71）的含量则较低，与哲罗鱼和虹鳟鱼Lv的氨基酸组成相似；与金鱼Vtg相比，Lv中Ser的含量减少了近50%，且两者都不含有Cys。这些结果证明纯化的蛋白为金鱼Lv。利用纯化的金鱼Lv腹腔注射小白鼠进行免疫，免疫周期为6周。采用免疫双扩散法，测得制备的鼠抗金鱼Lv多克隆抗血清效价为1:32；免疫双扩散还发现，Lv多克隆抗血清可以与雌鱼血浆反应，而与雄鱼血浆不发生反应，证明Lv为雌性特异性蛋白；免疫电泳实验表明Lv抗血清可以与Vtg发生免疫反应，仅形成一条免疫沉淀线，说明两者具有相同的免疫原性；Western blot检测显示抗血清特异性较好，在1:500倍稀释条件下对金鱼Vtg的最低检出限为1.1μg/mL。金鱼Lv多克隆抗血清能够与多种鱼的Vtg发生交叉反应，从而扩大了其应用范围。Western blot表明，金鱼Lv抗血清能够用于检测鲤鱼、鲫鱼血浆中的Vtg，它们都含有分子量为118和107kDa的两条主带，在斑马鱼匀浆液稀释200倍的情况下，仍能检测到分子量约为107kDa和99kDa的两条带；当美国红鱼Vtg浓度为1.1μg/mL时，该抗血清依然可能检测到多条带。此外，该抗血清还能与E2诱导下雄性石鲽的血浆表现出很好的交叉反应。可见，金鱼Lv抗血清可以用于环境雌激素的检测，并且具有广泛的应用范围。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 1 环境雌激素生物标志物筛选体系与鱼类卵黄脂磷蛋白研究进展
• 1.1 环境雌激素的生物标志物筛选体系
• 1.1.1 环境雌激素的种类
• 1.1.2 生物标志物在环境雌激素筛选方面的应用
• 1.2 鱼类卵黄脂磷蛋白性质研究进展
• 1.2.1 卵黄脂磷蛋白的来源
• 1.2.2 卵黄脂磷蛋白种类与结构
• 1.2.3 卵黄脂磷蛋白的生物学功能
• 1.2.4 卵黄脂磷蛋白的分子量
• 1.2.5 卵黄脂磷蛋白检测方法
• 1.2.6 卵黄脂磷蛋白纯化方法
• 1.3 研究展望
• 1.4 研究目的和技术路线
• 2 金鱼卵黄脂磷蛋白的分离纯化及性质鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验药品与仪器
• 2.2.2 实验材料
• 2.2.3 卵黄脂磷蛋白的分离纯化
• 2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色
• 2.2.5 卵黄脂磷蛋白的特征性染色
• 2.2.6 氨基酸组成分析
• 2.2.7 分子量的确定
• 2.2.8 蛋白质含量的测定
• 2.2.9 热稳定性检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 黄脂磷蛋白的分离纯化
• 2.3.2 卵黄脂磷蛋白的染色鉴定
• 2.3.3 卵黄脂磷蛋白的氨基酸组成
• 2.3.4 卵黄脂磷蛋白的分子量测定
• 2.3.5 卵黄脂磷蛋白的热稳定性检测
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗血清的制备及鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验药品与仪器
• 3.2.2 实验动物
• 3.2.3 卵黄脂磷蛋白多克隆抗血清的制备
• 3.2.4 抗血清的效价测定
• 3.2.5 抗血清的特异性分析
• 3.2.6 免疫电泳技术检测抗血清专一性
• 3.2.7 抗体特异性检测
• 3.2.8 卵黄原蛋白与卵黄脂磷蛋白免疫原性分析
• 3.2.9 多抗血清检出限测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 抗血清效价的测定
• 3.3.2 Lv 抗血清的特异性分析
• 3.3.3 抗血清专一性检测
• 3.3.4 抗血清特异性检测
• 3.3.5 卵黄原蛋白和卵黄脂磷蛋白免疫原性分析
• 3.3.6 抗血清检出限测定
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 抗血清与其他鱼类卵黄原蛋白的交叉反应
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 免疫印迹检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 鲤鱼和鲫鱼卵黄原蛋白与抗血清的交叉反应
• 4.3.2 斑马鱼卵黄原蛋白与抗血清的交叉反应
• 4.3.3 美国红鱼卵黄原白与抗血清的交叉反应
• 4.3.4 石鲽卵黄原蛋白与抗血清的交叉反应
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果