斜纹夜蛾的抗药性及其机理研究

论文摘要

斜纹夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）是一种重要的多食性害虫，生产上主要依靠化学防治。近些年来，该虫在我国许多地区频繁暴发，而且绝大多数常规药剂已不能有效控制其危害，因此，给农业生产造成了巨大损失。为了弄清斜纹夜蛾的抗药性现状和抗药性机理，建立有效的抗药性治理措施，提高现有的农药品种的防治效果，本文以筛选获得的斜纹夜蛾抗性和敏感性品系，以及田间抗性种群为材料，详细研究斜纹夜蛾的抗药性监测方法、抗药性现状、抗性的生化与分子机制及其抗性遗传规律，现将研究结果总结如下： 1 斜纹夜蛾抗药性监测方法与敏感毒力基线的建立 利用室内多年连续饲养的斜纹夜蛾，通过单卵块筛选获得了相对敏感品系，用3龄幼虫分别建立了点滴法和浸叶法两种斜纹夜蛾抗药性监测方法，并测定了10多种常用杀虫剂的敏感基线。进一步田间抗性监测表明，点滴法对触杀性杀虫剂较敏感，浸叶法对胃毒性较强的杀虫剂较敏感，但两种方法均能准确地确定斜纹夜蛾的抗性状况。与以前使用的4龄幼虫点滴法等相比，本研究建立的方法不仅准确可靠，而且省时省工，更重要的是，还提供了大量的敏感基线资料。因此，本研究所建立的抗药性监测方法，有望成为斜纹夜蛾抗药性监测的标准方法，并为斜纹夜蛾抗药性的深入研究奠定了基础。 2 斜纹夜蛾田间种群的抗药性状况 利用所建立的抗药性监测方法和敏感基线，对江苏南京和安徽和县两地斜纹夜蛾田间种群的抗药性进行了测定。结果表明，两地斜纹夜蛾种群对拟除虫菊酯类杀虫剂都产生高水平的抗性（63-477倍）；对有机磷和氨基甲酸酯类药剂，除江苏南京田间种群对丙溴磷（5.73倍）和灭多威（8.01倍）为低抗外，也都产生了中等水平的抗性（10.5-34.4倍）。但两地斜纹夜蛾种群对杀虫单、阿维菌素、氟铃脲和氟虫腈等药剂都未产生明显抗性（＜5倍）。因此，在抗药性治理方面，建议这两地在使用药剂防治斜纹夜蛾时，应避免使用拟除虫菊酯类药剂，有限制地使用有机磷类杀虫剂，合理轮用杀虫单、阿维菌素、氟铃脲和氟虫腈等药剂，以阻止和延缓抗性的发展。 3 溴氰菊酯高抗品系的筛选及其相对适合度和抗性遗传方式 利用田间抗性种群在室内用溴氰菊酯连续筛选6代，获得了斜纹夜蛾对溴氰菊酯的极高抗品系（RR：2246），为进一步研究抗性斜纹夜蛾的生物适合度、抗药性遗传方式、交互抗性和抗药性机理，奠定了基础。此外室内筛选还发现，溴氰菊酯筛选不仅使自身抗性增长了4.2倍，同时还使氰戊菊酯抗性增加

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.斜纹夜蛾抗药性的发生概况及其机理
• 2.昆虫抗药性的生理生化机制
• 2.1 表皮穿透速率降低
• 2.2 代谢抗性研究进展
• 2.2.1 多功能氧化酶系（MFOs）
• 2.2.1.1 P450基因的多样性及其结构特征
• 2.2.1.2 昆虫细胞色素P450基因的过量表达与抗药性
• 2.2.1.3 昆虫细胞色素P450基因的结构改变与抗药性
• 2.2.2 酯酶
• 2.2.2.1 羧酸酯酶的基因结构特征
• 2.2.2.2 酯酶在害虫抗药性中的作用
• 2.2.2.2.1 酯酶基因扩增
• 2.2.2.2.2 酯酶基因的突变
• 2.2.2.2.3 酯酶基因mRNA表达量的增加
• 2.2.3 谷胱甘肽-S-转移酶
• 2.3 杀虫剂靶标与抗药性的关系
• 2.3.1 钠离子通道
• 2.3.1.1 钠离子通道的结构及其与拟除虫菊酯类杀虫剂的相互作用
• 2.3.1.2 击倒抗性的分子机理
• 2.3.2 乙酰胆碱酯酶
• 3 斜纹夜蛾的抗性治理对策
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 斜纹夜蛾对常用杀虫剂的相对敏感毒力基线及抗药性监测
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 供试药剂
• 1.3 毒力测定方法
• 1.3.1 点滴法：
• 1.3.2 浸叶法：
• 2 结果与分析
• 2.1 敏感品系的验证
• 2.2 斜纹夜蛾对常用杀虫剂相对敏感毒力基线的建立
• 2.3 抗药性监测
• 3 讨论：
• 第三章 斜纹夜蛾抗溴氰菊酯品系的相对适合度和抗性遗传方式研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫及药剂
• 1.2 毒力测定方法
• 1.3 种群生命表的组建
• 1.4 抗性遗传分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 溴氰菊酯抗性斜纹夜蛾的相对生物适合度
• 2.2 抗性遗传特性分析
• 2.2.1 抗性基因的染色体遗传
• 2.2.2 抗性基因的显、隐性
• 2.2.3 抗性的单基因或多基因遗传
• 3 讨论
• 第四章 斜纹夜蛾抗药性的生化机制研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2供试药剂
• 1.3 毒力测定及增效剂的增效作用测定
• 1.4 离体酶活性测定
• 1.4.1 酶液制备
• 1.4.2 酯酶活性测定
• 1.4.3 多功能氧化酶的O-脱甲基活力（PNOD）测定
• 1.4.4 谷胱甘肽S—转移酶（GST）活性测定
• 50)测定'>1.4.5 乙酰胆碱酯酶的动力学参数和抑制中浓度(I₅₀)测定
• 1.4.6 蛋白质含量测定
• 1.4.7 数据分析
• 1.5 斜纹夜蛾para型钠离子通道基因ⅡS4-ⅡS6区域的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 斜纹夜蛾对常规药剂的抗性水平与交互抗性
• 2.2 增效剂TPP、PBO和DEM的增效作用测定
• 2.3 代谢酶活性测定
• 2.4 乙酰胆碱酯酶的动力学参数及敏感性的测定
• 2.5 斜纹夜蛾钠离子通道基因ⅡS4-ⅡS6的序列分析
• 3.讨论
• 第五章 斜纹夜蛾细胞色素P450基因的克隆与定量分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 总RNA的制备
• 1.3 cDNA第一链的合成
• 1.4 引物设计及细胞色素P450 cDNA片段的PCR扩增
• 1.5 PCR产物的纯化、克隆及测序测定
• 1.5.1 PCR产物的纯化
• 1.5.2 连接反应
• 1.5.3 转化
• 1.5.4 单克隆的挑选
• 1.5.5 小量质粒DNA的提取与酶切检测
• 1.5.6 序列测定
• 1.6 细胞色素P450基因全长的克隆
• 1.7 斜纹夜蛾细胞色素P450基因分子树的构建和系统发育分析
• 1.8 斜纹夜蛾细胞色素P450基因的定量分析
• 1.8.1 总RNA的提取：
• 1.8.2 引物设计
• 1.8.3 实时荧光定量PCR反应
• 1.8.4 实时荧光定量PCR反应效率的确定
• 1.8.5 斜纹夜蛾P450基因mRNA表达量比较
• 2 结果与分析
• 2.1 斜纹夜蛾CYP4基因cDNA片段的克隆与分析
• 2.2 斜纹夜蛾重要CYP4基因全长cDNA的克隆与分析
• 2.3 PCR产物熔解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性分析
• 3 讨论
• 3.1 CYP4家族P450基因的多样性
• 3.2 细胞色素P450基因的过量表达与昆虫抗药性的关系
• 第六章 斜纹夜蛾酯酶的生化特性及其酯酶基因的相对表达水平研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2主要试剂
• 1.3 酶液制备
• m和V_max的测定'>1.4 酯酶动力学参数K_m和V_max的测定
• 1.5 酯酶的抑制试验
• 1.6 酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.7 斜纹夜蛾酯酶的亚细胞分布
• 1.8 蛋白质含量测定
• 1.9 斜纹夜蛾酯酶基因cDNA克隆
• 1.10 斜纹夜蛾酯酶基因Slest2全长的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 斜纹夜蛾抗性和敏感品系的酯酶动力学参数的比较
• 2.2 斜纹夜蛾抗性和敏感品系酯酶的亚细胞分布
• 2.3 溴氰菊酯和丙溴磷对斜纹夜蛾酯酶的抑制效应
• 2.4 酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.5 斜纹夜蛾酯酶基因cDNA片段的克隆
• 2.6斜纹夜蛾酷酶基因Slest2的全长序列分析
• 2.7 PCR产物熔解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性分析
• 2.8 斜纹夜蛾酯酶基因相对表达量和拷贝数的比较
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录：攻读博士学位期间学术论文的发表情况
• 致谢