碘化N-正丁基氟哌啶醇及钙拮抗剂对缺氧复氧大鼠心肌细胞损伤的保护及其作用机制的研究

论文摘要

早期生长反应因子-1（Egr-1）是一种即早基因，可经多种刺激因素诱导而表达，近年来，许多研究借助于基因敲除技术或反义寡核苷酸技术，证明Egr-1在缺血再灌注损伤（I／R）中起到中心性的作用。前期研究表明，碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2）可通过抑制I／R心肌中Egr-1的表达起到抗心肌I／R的作用，F2的这种保护机制究竟是仅通过Egr-1起作用，还是有其它的机制参与仍不清楚。故本实验在应用反义寡核苷酸的基础上加用F2，进一步揭示F2的分子作用机制。另外，F2可通过阻断心肌细胞和血管平滑肌细胞膜钙通道，防止钙超载，对I／R损伤心肌起到良好的保护作用。细胞内钙超载是心肌I／R损伤的病理机制之一，Ca2+又可以通过多种途径调节Egr-1基因表达。钙离子拮抗剂通过降低细胞内钙浓度，防止钙超载而达到抗心肌I／R损伤，已被广泛接受。既然F2可通过阻断钙通道，又可通过抑制Egr-1的表达而起到抗I／R损伤的作用，那么，钙离子拮抗剂是否也同F2一样，可通过抑制Egr-1表达而拮抗心肌I／R损伤呢?本实验培养大鼠心肌细胞缺氧复氧模型，探讨F2和三种钙离子拮抗剂：维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平对心肌缺氧复氧损伤及Egr-1基因表达的影响。方法1 H／R模型建立：将细胞用PBS洗两次后，换用被高纯氮气饱和的缺氧液，置于密闭且充满氮气的缺氧箱中，37℃缺氧3 h，后又在正常培养条件下培养1 h，造成H／R损伤。2实验分组：第一部分：取生长5-6 d的原代心肌细胞进行随机分组：对照（Control）组、H／R组、溶剂[PEG+LIP（脂质体）]组、反义寡核苷酸（AS）组和AS+F2组；脂质体与AS提前24 h加入，F2组于缺氧液及复氧液中给予F2(1×10-6mol／L)，AS组与PEG+LIP组亦于缺氧液及复氧液中加入与F2等容积的PEG。除Control组外，其余各组均作H／R模型。第二部分：取生长5-6 d的原代心肌细胞进行随机分组：Control组、H／R组、DMSO组、维拉帕米（Ver）、地尔硫卓（Dil）组、硝苯地平（Nif）组。维拉帕米、地尔硫卓、硝苯地平的用量分别是2×10-6mol／L、1×10-5mol／L、1×10-5mol／L。除Control组外，其余各组均作H／R模型。3普通光学及倒置相差显微镜下观察培养心肌细胞形态结构的变化及其搏动情况。4用比色法测定细胞培养上清液中肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性，用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）的含量，黄嘌呤氧化酶法测定心肌细胞中超氧化物歧化酶（SOD）的活性及双抗体夹心光化学测定法，检测细胞培养上清液中心肌肌钙蛋白（cTnI）的浓度。5 ELISA法测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量6 RT-PCR法检测培养心肌细胞Egr-1 mRNA的表达水平。7 Western-blot法检测培养心肌细胞中Egr-1蛋白的表达水平。结果一、Egr-1反义寡核苷酸在大鼠心肌细胞的转染情况FITC标记的反义寡核苷酸在488nm的激发光源下呈现绿色，荧光显微镜下可见细胞核及细胞浆中有绿色荧光。二、F2及AS对缺氧复氧心肌细胞Egr-1蛋白表达的影响F2对培养心肌细胞Egr-1蛋白表达水平的影响：Western-blot结果显示：与Control组相比，H／R组及PEG+LIP组培养大鼠心肌细胞Egr-1蛋白的表达水平明显增高（P＜0.05），AS组和AS+F2组Egr-1蛋白的表达较H／R组明显下调，且AS组和AS+F2组之间差别无统计学意义（P＞0.05）。三、F2及AS对培养大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响1 F2及AS对培养心肌细胞形态结构的影响：与Control组相比，H／R组及PEG+LIP组心肌细胞出现伪足收缩减少、搏动节律紊乱，AS组和AS+F2组心肌形态较H／R组明显改善，搏动节律也明显恢复，且AS+F2组恢复的更为明显。2 F2及AS对培养心肌细胞上清液中LDH、CK活力及cTnI和TNF-α含量的影响：H／R组及PEG+LIP组培养上清液中LDH、CK活力及cTnI和TNF-α含量较Control组显著增高（P＜0.01）。与H／R组比AS组和AS+F2组LDH、CK活力及cTnI和TNF-α含量明显降低（P＜0.01），且AS+F2组降低的更为明显，与AS组相比具有统计学意义（P＜0.05）。3 F2及AS对培养心肌细胞SOD活力及MDA含量的影响：H／R组及PEG+LIP组SOD活力较Control组显著降低，MDA含量较Control组显著增高，而在应用AS及AS+F2以后，心肌细胞SOD活力明显升高（P＜0.01），MDA含量明显降低（P＜0.01），且AS+F2组改善作用与AS组比更为明显（P＜0.05）。四、钙离子拮抗剂对培养大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响1钙离子拮抗剂对培养心肌细胞上清液中LDH、CK活力的影响：H／R组及DMSO组培养上清液中LDH、CK的活力较Control组显著增高（P＜0.01）。与H／R组比Ver组、Dil组及Nif组LDH、CK活力含量明显降低（P＜0.05）。2钙离子拮抗剂对培养心肌细胞SOD活力及MDA含量的影响：H／R组及DMSO组SOD活力较Control组显著降低，MDA含量较Control组显著增高，而在应用维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平以后，心肌细胞SOD活力明显升高（P＜0.01），MDA含量明显降低（P＜0.01）。五、钙离子拮抗剂对缺氧复氧心肌细胞Egr-1 mRNA的表达和Egr-1蛋白表达的影响1钙离子拮抗剂对培养心肌细胞Egr-1mRNA表达水平的影响：RT-PCR结果显示：与Control组相比，H／R组及DMSO组培养大鼠心肌细胞Egr-1mRNA的表达水平明显增高（P＜0.05）。Ver组、Dil组、Nif组Egr-1 mRNA的表达较H／R组明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。2钙离子拮抗剂对培养心肌细胞Egr-1蛋白表达水平的影响：Weaern-blot结果均显示：与Control组相比，H／R组及DMSO组培养大鼠心肌细胞Egr-1蛋白的表达水平明显增高，Ver组、Dil组、Nif组Egr-1蛋白的表达较H/R组明显下调。结论1 F2可通过抑制Egr-1的表达，减轻H/R心肌细胞损伤，这是其抗心肌I/R损伤作用的机制之一。2 F2还可通过其他作用机制对H/R心肌细胞起到保护作用。3维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平均可抑制Egr-1 mRNA和Egr-1蛋白的表达，减轻H/R心肌细胞损伤。对Egr-1表达的抑制效应可能是钙离子拮抗剂保护I/R心肌组织的另一共性作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 目录
• 前言
• 第一部分
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢