论文摘要
利用Rh阴性孕妇血浆中提取的游离胎儿DNA,来寻求一种胎儿RhD血型产前基因诊断的可行性方法,并以此作为诊断和预防新生儿溶血病的一种手段推广于临床应用,本文将从以下两个方面进行探讨。一、应用PCR-SSP技术进行胎儿RhD血型的基因诊断已有的研究资料显示Rh血型基因（RH）位于人类染色体1p34.3～36.1区域,主要由紧密连锁的RHD和RHCE基因串联排列组成。RHD基因编码RhD多肽,RHCE基因编码RhC/c和RhE/e多肽。临床上通过检测红细胞膜表面有无D抗原将Rh血型分为Rh阳性和Rh阴性两种。Rh血型血清学检测主要是D、C、E、c和e等5种抗原,其中D抗原具有很强的免疫原性,它是Rh阴性孕妇与胎儿血型不合引起新生儿溶血病（HDN）发生的最主要抗原之一。经研究表明不同种族Rh阴性个体因遗传背景不同RHD基因结构存在很大差异,高加索人中Rh阴性个体绝大部分是RHD基因完全缺失;中国人约有38%Rh阴性个体存在不同程度携带RHD等位基因:非洲黑人有80%Rh阴性个体普遍携带RHD等位基因,其中66%为RHD假基因（RHDΨ）。目前,我国产前诊断胎儿RhD血型是依靠从绒毛膜滋养层细胞或羊水中获得胎儿DNA,然后对胎儿组织DNA进行RHD基因的扩增,该方法为侵入性取材,有引起胎儿流产以及加重胎儿病情的危险。另一方面,借用国外基因定型的方法仅扩增外显子10,该方法不适合用于中国人的检测,易造成假阳性。近年来,通过RHD等位基因的深入研究以及孕妇血浆中游离胎儿DNA的发现,为非侵入性产前诊断胎儿RhD血型提供了新思路。国外关于利用RhD阴性孕妇血浆游离DNA进行胎儿RhD血型产前诊断的研究已获得成功,并在临床上开始逐步推广和运用。在我国,因D变异体的多样性和复杂性,与国外相比D变异体的基因结构和频率存在很大差异,国外有关RhD血型的基因分型方法并不适合中国人。在亚洲,约30%的RhD阴性个体为Del表型,该表型的等位基因有10多种,在我国仅发现一种等位基因RHD1227A,并成为我国Del表型基因诊断的特征性遗传标志物。本实验借鉴国外的一些基因定型方法,再结合我国Rh血型D抗原变异体最新研究成果来设计相应的特异性引物,采用PCR-SSP技术成功地预测出胎儿RhD血型,探索出了一条适合于中国人RhD血型产前基因诊断的方法,该方法可用于新生儿溶血病的诊断和预防以及临床推广运用。实验方法1、筛选孕周为11～40周,B超确定为单胎的孕妇。2、用常规血清学方法筛选出RhD阴性孕妇。3、采用德国Qiagen公司DNA提取试剂盒提取孕妇血浆中游离DNA。4、建立PCR-SSP检测方法用于RhD血型的基因定型。5、利用胎-母共有的β-globin（GLO）基因检测总DNA。6、利用男性胎儿所特有的SRY基因确定孕妇血浆中游离胎儿DNA。7、根据RHD和RHCE外显子、内含子之间的差异设计一套特异性引物进行扩增。8、结合我国Del表型等位基因结构特点设计一套引物对基因定型RhD阳性者进一步进行Del血型筛选。9、筛选的Rh阴性孕妇产后新生儿性别观察并收集脐血进行Rh血型血清学鉴定。10、利用新生儿脐血进行吸收-放散试验检测Del表型。结果1、血清学方法筛选出RhD阴性孕妇58例。2、通过GLO和SRY基因扩增同时出现阳性结果32例。3、扩增内含子4、外显子5、7、10基因结果全部阳性24例。4、扩增内含子4、外显子5、7、10结果全部阴性6例。5、1例只扩增出外显子7、10。6、1例仅扩增出外显子10。7、24例扩增结果全部阳性的样本进一步扩增RHD1227A等位基因出现阳性结果2例。8、基因定型结果与胎儿脐血血清学表型结果相一致28例,其符合程度达到87.5%（28/32）。9、通过检测RHD1227A等位基因鉴定了RhD放散型2例,最终准确率93.75%（30/32）。结论利用PCR-SSP技术,结合中国人RhD血型D抗原变异体基因结构特点设计的一套特异性引物,应用于Rh阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA扩增进行非创性诊断胎儿RhD血型是一种简便、快速、准确度高且无损伤性的产前基因诊断的可行性方法,可用于新生儿溶血病的预防和诊断,值得临床推广应用。二、应用实时定量PCR技术进行胎儿RhD血型的基因诊断在前期工作中,我们运用了PCR-SSP方法仅对男性胎儿进行了RhD血型的预测,没有对女性胎儿进行检测。为了获得完整的研究资料,同时也为了排除方法上的一些技术因素所造成的干扰,更是为了提高检测方法的灵敏度和特异性,我们采用了实时定量PCR技术再次成功地预测出胎儿RhD血型,并建立了一套完整地胎儿RhD血型产前基因诊断的可行性方法。实验方法1、寻找孕周为11～40周,经B超确定为单胎的孕妇。2、用常规血清学方法筛选出RhD阴性孕妇。3、采用德国Qiagen公司DNA提取试剂盒提取孕妇血浆中游离DNA。4、采用北京PEL-FREEZ公司DNA提取试剂盒提取孕妇白细胞层DNA。5、利用胎-母共有的β-globin（GLO）基因检测总DNA的存在。6、利用男性胎儿所特有的SRY基因确定孕妇血浆中胎儿游离DNA的存在。7、SRY基因扩增结果为阴性的,进一步对孕妇白细胞层DNA及其游离DNA分别进行STR多态性重复序列的扩增,通过对比寻找胎儿游离DNA中可能存在的父源性基因片断。8、根据RHD和RHCE外显子、内含子之间的差异设计一套特异性引物。9、利用标准品建立特异性基因拷贝数标准曲线。10、采用实时定量PCR技术进行检测。11、结合我国Del表型基因结构特点设计一套引物对基因定型RhD阳性者进一步筛选。12、筛选出的Rh阴性孕妇产后新生儿性别观察并收集脐血进行Rh血型血清学鉴定。13、纯化RHD1227A等位基因扩增阳性产物,进一步进行直接测序。结果1、血清学方法筛选出RhD阴性孕妇78例。2、通过GLO和SRY基因扩增阳性结果41例,证实了胎儿DNA的存在。3、37例SRY基因扩增结果阴性样品DNA进行STR多态性分析全部获得父源性基因片段,证实了从血浆中提取胎儿DNA获得成功。4、内含子4、外显子5、7、10基因扩增结果全部阳性65例。5、内含子4、外显子5、7、10基因扩增结果全部阴性10例。6、1例只有外显子7、10扩增出阳性结果。7、2例仅有外显子10扩增出阳性结果。8、65例扩增结果全部阳性的样品DNA进一步扩增RHD227A等位基因出现阳性结果5例。9、基因定型结果与血清学表型结果相符70例,总符合率为90%（70/78）。10、5例出现RHD1227A等位基因阳性产物直接测序显示在外显子9和内含子9之间1227位置存在G＞A碱基突变。11、通过检测RHD1227A等位基因鉴定了RhD放散型5例,最终准确率95%（74/78）。结论运用实时定量PCR技术进行非创性胎儿RhD血型的产前诊断,有利于基因诊断技术的标准化,该方法的运用提高了检测结果的特异性和灵敏度,使检测结果得到量化,是一种能准确预测胎儿RhD血型的可行性方法。
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