鲢鱼、鳙鱼、草鱼谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及组织表达研究

论文摘要

GPX是一个多酶家族的统称，其中一部分酶有依赖硒的谷胱甘肽过氧化物酶活性并含有独特的UGA编码的硒代半胱氨酸（selenocysteine SeC），简称Se-GPx。本研究利用RT-PCR技术分别从淡水食毒藻鱼类鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙鱼（Aristichthys nobilis）及草食性鱼类草鱼（Ctenopharyngodon idella）肝脏扩增出谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）cDNA核心序列。序列分析表明鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX基因的cDNA核心序列均为263bp。进一步采用RACE法与基因组步行法，克隆鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPx基因3’端序列、鲢鱼GPX基因5’端序列及5’侧翼序列，通过序列拼接得到鳙鱼653bp、草鱼666bp的部分cDNA序列和892bp的鲢鱼GPX cDNA全序列和长度为750bp的5’侧翼区序列。该序列包括一个576bp的开放阅读框（编码191个氨基酸），25bp的5’UTR和291 bp的3’UTR。由该序列推断的多肽分子量为21.59 kDa，其中第四十位氨基酸为TGA编码的硒代半胱氨酸。序列比对分析结果显示，鲢鱼、鳙鱼、草鱼与斑马鱼（Danio rerio）（同属鲤科）、条石鲷（Oplegnathus fasciatus）、（鲈形目）等鱼类GPX氨基酸序列同源性很高，为75％-93％。鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX与其它生物GPX的系统进化分析表明所克隆得到的鲢鱼、鳙鱼、草鱼的GPX应为GPX2型。不同的是，哺乳动物中GPX2只在胃、肠中表达，鲢鱼GPX在肝脏、脂肪、肠、肌肉和脑中都有广泛的表达。以β-肌动蛋白为外参照，比较鲢鱼、鳙鱼、草鱼肝脏GPX基因的表达水平发现，鲢鱼、鳙鱼肝脏GPX的表达量远高于草鱼肝脏GPX的表达量，这与鲢鱼、鳙鱼大量摄入微囊藻毒素在鱼体内引发产生过量的脂过氧化物相适应。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第1章 前言
• 1 淡水生态系统中微囊藻毒素的产生原因及其污染现状
• 2 微囊藻毒素的结构、毒性与危害
• 3 淡水生态系统中微囊藻毒素的代谢途径
• 3.1 微囊藻毒素的非生物净化
• 3.2 微囊藻毒素的生物净化
• 3.2.1 微囊藻毒素在水栖微生物体内的降解
• 3.2.2 食物链在微囊藻毒素代谢中的作用
• 3.2.2.1 微囊藻毒素的生物聚集
• 3.2.2.2 藻类和水生维管束植物对微囊藻毒素的聚集
• 3.2.2.3 浮游动物和贝类对微囊藻毒素的聚集
• 3.2.2.4 鱼类对微囊藻毒素的聚集
• 3.2.3 微囊藻毒素在淡水生态系统食物链中的净化
• 4 水生生物微囊藻毒素去毒分子机理及调控机制
• 5 GPX的研究进展
• 5.1 GPX及其基因分类
• 5.2 GPX-1的功能及结构
• 6 本文的研究目的与意义
• 7 研究思路
• 第二章 鲢鱼、鳙鱼、草鱼谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及组织表达研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验鱼
• 1.1.2 试剂盒,试剂,引物合成与序列测定
• 1.2 方法
• 1.2.1 总RNA提取
• 1.2.2 鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX cDNA核心序列的克隆
• 1.2.2.1 引物设计
• 1.2.2.2 RT-PCR扩增鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX cDNA核心片段
• 1.2.2.3 PCR产物的T载体克隆
• 1.2.2.3.1 琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物
• 1.2.2.3.2 重组T质粒的构建
• 1.2.2.3.3 重组质粒的转化
• 1.2.2.3.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.2.3.3.2 重组质粒的转化
• 1.2.2.3.4 阳性克隆的筛选（蓝白斑筛选）
• 1.2.2.3.5 阳性克隆的鉴定（菌落PCR鉴定）
• 1.2.2.3.6 序列测定与分析
• 1.2.3 3’-RACE法扩增鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPXcDNA 3’末端序列
• 1.2.3.1 引物设计
• 1.2.3.2 半巢式PCR反应
• 1.2.3.3 3’-RACE PCR产物的T载体克隆
• 1.2.4 5’-RACE法扩增鲢鱼GPX cDNA 5’末端序列
• 1.2.4.1 引物设计
• 1.2.4.2 半巢式PCR反应
• 1.2.4.3 5’-RACE PCR产物的T载体克隆
• 1.3 基因组步行法克隆鲢鱼GPX基因5’-侧翼区序列
• 1.4 同源性分析及系统进化树重建
• 1.5 鲢鱼GPX在肝脏、脂肪肠、肌肉、脑中的表达
• 1.6 鲢鱼、鳙鱼、草鱼肝脏GPX mRNA水平的测定
• 1.7 统计分析
• 2 实验结果
• 2.1 鲢鱼、鳙鱼、草鱼肝脏总RNA的提取
• 2.2 鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX cDNA核心片段的克隆
• 2.2.1 RT-PCR扩增鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX cDNA核心片段
• 2.2.2 PCR产物的T载体克隆和序列测定
• 2.3.3’-RACE法扩增鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX cDNA 3’末端序列
• 2.4 鲢鱼GPX基因全长cDNA序列的克隆
• 2.4.1 5’-RACE法扩增鲢鱼GPX基因cDNA 5’末端序列
• 2.5 基因组步行法克隆鲢鱼GPX基因5’-侧翼区序列
• 2.6 克隆所得鳞鱼、缩鱼、草鱼GPI cNDA核苷酸序列及推导的氨基酸序列
• 2.7 鲢鱼GPX基因全长cDNA序列及推导的氨基酸序列
• 2.8 鲢鱼GPX基因基因5’-侧翼区序列
• 2.9 GPX基因在鲢鱼肝脏、脂肪肠、肌肉、脑中的表达
• 3.0 鲢鱼、鳙鱼、草鱼肝脏GPX基因的表达
• 4 实验结果分析
• 4.1 不同物种GPX cDNA序列分析
• 4.2 鲢鱼GPX基因5’-侧翼区序列结构分析
• 4.3 鲢鱼、鳙鱼、草鱼与其他物种GPX cDNA的氨基酸序列同源性比较
• 4.4 鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX与其它生物GPX的系统进化分析
• 4.5 鲢鱼、鳙鱼、草鱼肝脏GPX cDNA表达差异比较
• 第三章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录一 常用试剂与缓冲液的配置
• 致谢