重组人成纤维细胞生长因子21的中试研究及其对非酒精性脂肪肝的治疗作用研究

论文摘要

成纤维细胞生长因子21（Fibroblast growth factor 21,FGF21）是成纤维细胞生长因子家族的新成员,是一种特异性作用于肝脏、胰岛、和脂肪组织的新型代谢调控因子。FGF21具有降低机体血糖血脂、改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞等多种糖脂代谢调控的功能,因此,其在2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、脂肪肝等多种代谢综合症的临床应用方面极具潜力。非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是以肝小叶内的肝实质细胞脂肪变性、炎性细胞浸润和脂肪沉积为主要病理表现,但无伴随过量饮酒史、病毒感染或其他病原体的一种代谢综合症,目前在临床上尚无特效的NAFLD治疗药物。动物模型研究结果表明,FGF21能够显著降低血清中甘油三脂、胆固醇以及低密度脂蛋白的含量,显示其具有治疗NAFLD的潜能。本研究首先利用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达可溶性重组人FGF21,并利用3T3-L1细胞测定重组蛋白的糖吸收活性。然后,通过建立NAFLD的动物模型,评估FGF21对NAFLD的治疗作用,并探讨其作用机制。将含组氨酸标签的fgf21基因片段与大肠杆菌表达载体pET-3c连接后,获得重组表达质粒pET-fgf21并转化到宿主菌Origami B（DE3）中。最佳表达条件筛选结果显示,在20℃,1 mmol/L IPTG的条件下诱导20 h, rhFGF21表达量占菌体上清总蛋白的22.1%,且为可溶性表达。为了满足临床以及日常应用的需要,本研究对重组菌进行中试生产（50L）及纯化工艺研究。结果表明,以葡萄糖作为碳源,酵母提取物和蛋白胨作为氮源,并添加微量元素MgSO4 0.3 g/L, K2HPO4 2.5 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, NaCl 4.0 g/L的培养基中,重组菌株的最佳生长温度为37℃,诱导温度为20℃,最佳溶氧含量>30%,最佳诱导时间为细菌湿重达30g时,最佳诱导pH值为7.2～7.4。以此条件下,诱导20 h后,菌体湿重达到51.3g/L, rhFGF21可溶性表达量为33.4%。采用Ni-NTA Sepharose和Sephadex S100联用的层析方法,可以获得纯度97%以上的rhFGF21,得率为213 mg/L。Western blot、精确分子量测定、HPLC及肽指纹图谱分析结果显示,本研究得到的rhFGF21序列与其它文献报道的一致。此外,纯化后的rhFGF21蛋白在含3%海藻糖的PBS中,即使在-20℃放置20周后仍未见明显降解和活性下降。这种保存方法有效解决FGF21的降解难题,并为日后重组蛋白的生产、运输以及应用提供重要的实验基础。在细胞活性方面,rhFGF21对小鼠3T3-L1脂肪细胞具有显著的糖吸收促进作用,EC50为2.21 nM,与FGF21标准品比较无显著性差异。在另一方面,0.5μg/ml rhFGF21可持续显著上调小鼠3T3-L1脂肪细胞GLUT1 mRNA表达。此外,rhFGF21在0.125～32μg/ml的范围内对HepG2细胞无促增殖作用,但在0.25～4μg/ml的范围内对AKT抑制剂引起的存活抑制有拮抗效应。这个结果说明,纯化的rhFGF21具有促糖吸收活性,并能启动AKT途径,增加细胞活力。建立高脂饮食喂饲的小鼠非酒精性脂肪肝模型,并利用rhFGF21对NAFLD进行治疗。结果显示,0.15mg/kg/d、0.5 mg/kg/d、1 mg/kg/d rhFGF21在给药10-20 d时均表现出显著的降低体重作用,而20-30 d后实验小鼠体重趋于稳定。各剂量rhFGF21处理组小鼠空腹胰岛素、空腹血糖和胰岛素稳态评价指数（HOMA-IR）均显著低于HFD模型组,表明rhFGF21可显著改善NAFLD小鼠的胰岛素抵抗水平。在肝功能以及血脂指标方面,各剂量rhFGF21处理组能显著降低小鼠血清中ALT、AST、ALP、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平,说明rhFGF21能够改善NAFLD小鼠的肝功能,同时具有降血脂和肝脂效果。此外,与HFD模型组相比,各剂量rhFGF21处理组中肝组织的ROS含量显著降低,线粒体肿胀程度减轻,结构完整,肝细胞内脂滴蓄积大量减少,说明rhFGF21能够降低NAFLD小鼠肝脏的氧化应激水平,保护肝细胞线粒体的正常结构。应用不同剂量rhFGF21给予NAFLD小鼠治疗后,病理分析显示,各处理组肝脏病理改变出现不同程度逆转,肝脏脂肪积蓄,炎症浸润和胶原纤维增生等病理变化显著缓解。本研究还对rhFGF21治疗NAFLD小鼠的分子机制进行了探讨。结果表明,重组蛋白能显著上调NAFLD小鼠肝脏的SIRT1、SREBP-2、LDLR蛋白的表达,提示rhFGF21通过上调SIRT1的表达来抵御氧化应激,并通过上调肝细胞膜上的SREBP-2、LDLR表达,增加对血中胆固醇的摄取,降低血浆LDL水平,促进胆固醇的清除。此外,Q-PCR结果显不,rhFGF21能显著下调ACC1、ACC2、FAS、SCD1等脂肪代谢关键酶的mRNA表达,通过影响ACC-MA途径抑制脂肪合成,促进脂肪酸β氧化,减少肝脏TG蓄积。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 前言
• 1 成纤维细胞因子21的研究概况
• 1.1 FGF21的结构
• 1.2 FGF21的生物学功能
• 1.3 FGF21的临床安全性与工程化现状
• 2 非酒精性脂肪肝
• 2.1 NAFLD的发病机制
• 2.2 NAFLD的治疗现状
• 2.3 FGF21与NAFLD
• 3 立题依据及设计思路
• 第二章 FGF21的克隆表达、纯化及中试研究
• 1 仪器与材料
• 2 实验方法
• 2.1 基因的设计、扩增与克隆
• 2.2 重组蛋白FGF21的表达分析
• 2.3 重组蛋白的发酵工艺
• 2.4 重组蛋白rhFGF21的纯化鉴定
• 3 实验结果
• 3.1 基因的设计、扩增与克隆
• 3.2 重组蛋白的表达
• 3.3 重组蛋白的中试发酵
• 3.4 重组蛋白的纯化与鉴定
• 4 讨论
• 第三章 重组人成纤维细胞因子21的体外活性测定
• 1 仪器与材料
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠3T3-L1脂肪细胞培养及分化
• 2.2 糖吸收活性测定实验
• 2.3 rhFGF21对3T3-L1脂肪细胞中GLUT1 mRNA表达的影响
• 2.4 HepG2细胞培养
• 2.5 促增殖活性测定
• 2.6 FGF21对AKT抑制剂（LY294002）引起的细胞存活力变化的影响
• 2.7 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 3T3-L1分化为成熟的脂肪细胞
• 3.2 rhFGF21对3T3-L1脂肪细胞的糖吸收促进作用
• 3.3 rhFGF21对3T3-L1脂肪细胞GLUT1mRNA表达的影响
• 3.4 rhFGF21对HepG2细胞的促增殖活性测定
• 3.5 rhFGF21对LY294002引起的HepG2细胞存活力变化的影响
• 4 讨论
• 第四章 高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立
• 1 实验仪器与材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 实验动物
• 1.3 基础饲料
• 1.4 高脂饲料
• 2 实验方法
• 2.1 实验动物饲养和分组
• 2.2 处死动物,留取标本
• 2.3 胰岛素含量测定和生化指标测定
• 2.4 生化指标测定
• 2.5 组织病理学检测
• 2.6 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 体重及肝指数变化
• 3.2 血清脂蛋白变化
• 3.3 空腹胰岛素含量及稳态胰岛素评价指数
• 3.4 肝功能相关酶活改变
• 3.5 肝脏的组织病理学改变
• 4 讨论
• 第五章 RHFGF21对小鼠非酒精性脂肪肝的治疗作用及其机制研究
• 1 实验仪器与材料
• 1.1 实验仪器及试剂
• 1.2 实验动物
• 1.3 基础饲料
• 1.4 高脂饲料
• 2 实验方法
• 2.1 实验动物饲养和分组
• 2.2 实验动物给药
• 2.3 处死动物,留取标本
• 2.4 血清学指标测定
• 2.5 肝脏甘油三酯和胆固醇含量测定
• 2.6 组织病理学检测
• 2.7 rhFGF21对实验动物肝脏氧化应激水平的影响
• 2.8 Western blot检测肝组织中脂代谢相关蛋白的表达
• 2.9 Real time RT-PCR检测肝组织中相关基因的表达水平
• 2.10 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 实验动物体重变化
• 3.2 实验小鼠的肝指数
• 3.3 实验动物的空腹血糖（FG）、空腹胰岛素（FINS）和稳态胰岛素评价指数
• 3.4 实验动物的血脂测定结果
• 3.5 实验动物的肝功能相关酶活测定
• 3.6 实验动物的肝脏胆固醇、甘油三酯含量
• 3.7 实验动物肝组织病理检查
• 3.8 rhFGF21对实验动物肝脏氧化应激水平的影响
• 3.9 rhFGF21对肝组织中脂代谢相关蛋白的表达影响
• 3.10 rhFGF21对肝组织中脂代谢相关基因表达的影响
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 附录一:各种试剂和培养基的配制
• 附录二:DNA测序结果图
• 附录三:PMF图谱
• 英文缩略词表
• 博士期间发表论文
• 致谢