论文摘要
背景和目的:无论是1型糖尿病或2型糖尿病患者,或早或晚都要进入烦琐的胰岛素替代治疗阶段,其共同原因是胰岛细胞数量的下降导致胰岛素分泌的缺乏。胰岛移植被认为是目前可能治愈糖尿病的最有效方法之一。而理想的供体胰岛细胞来源的匮乏是胰岛移植相关研究的重要障碍。原代胰岛细胞体外增殖能力差,研究者利用各种生长因子与胰岛β细胞共孵育,其增殖仍然有限,而且随着细胞的衰老与去分化,细胞群也逐渐丧失其原有表型与胰岛素分泌功能。研究者利用猿猴病毒大T抗原基因（simian virus 40 large T antigen gene,SV40LTAg）或人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）诱导细胞发生永生化,可增加原代细胞的体外扩增能力。但是,原癌基因长期存在于细胞内,具有潜在的致癌危险性,而且,永生化细胞的表型及功能特性与原代细胞相比,往往相差甚远。将已经得到成熟、广泛应用的条件基因敲除技术――Cre/LoxP系统,联合转基因技术诱导细胞永生化,又称可回复性永生化技术（reversible immortalization）,为解决胰岛β细胞的材料问题提供了新的思路及手段。其基本原理是,构建含永生化基因及其侧翼带两同向LoxP序列的重组载体,对原代细胞进行转染,使之发生永生化,得到相当数量细胞后,利用位点特异性重组酶Cre识别特异性位点LoxP,从而切除位于两同向LoxP序列之间的永生化基因,使细胞回复到永生化前的状态。这样既解决了原代细胞的体外增殖问题,又克服了由于永生化基因保留在细胞内,使得细胞安全性差、功能分化差的缺点。目前已陆续有研究者借助该项技术,诱导获得肝细胞、成纤维细胞、嗜铬细胞、神经干细胞等可回复性永生化细胞。有研究表明,单独转染hTERT,不足以促进体外培养的胰岛β细胞或角质化细胞的大量增殖。提示:hTERT致细胞永生化可能存在组织特异性。另有研究提示,无论是端粒依赖的还是非端粒依赖途径的细胞增殖与衰老的模型中,p16INK4A、p21CIP1/WAF1均具重要作用。而SV40LTAg与p16/Rb、p53/p21通路均具作用,因此,本研究拟将SV40LTAg单独转染入大鼠胰岛β细胞,以获得永生化的胰岛β细胞。此外,虽然单独转染hTERT未能促进β细胞的大量扩增,但如果将SV40LTAg、hTERT同时转染入胰岛β细胞,与单独转染SV40LTAg相比,两者的表型与生物学性状不知是否有所区别。为寻求一种简便的、实用的理想技术手段,以获得可大量扩增的、安全有效的胰岛β细胞,因此,本研究拟利用Cre/LoxP系统联合SV40LTAg或SV40LTAg、hTERT分别致大鼠胰岛β细胞可回复性永生化,待其体外大量扩增后,以Cre重组酶识别LoxP序列,切除永生化基因,获得回复后细胞。对两种回复后细胞的表型、功能及致瘤性等进行研究,为解决胰岛β细胞的材料问题提供实验基础。方法:（1）构建可回复性永生化逆转录病毒载体phTERT-I-GTKlox（含hTERT）,鉴定可回复性永生化逆转录病毒载体pLCRSTP（含SV40LTAg、Cre-ER）。（2）采用胆总管内插管、胶原酶灌注消化及Ficoll400梯度离心法分离纯化原代大鼠胰岛,以DTZ染色、AO-PI染色、胰岛素与Pdx-1免疫荧光双标染色鉴定大鼠胰岛的纯度及活率。（3）以Phoenix A包装细胞,分别包装pLCRSTP、phTERT-I-GTKlox逆转录病毒颗粒。（4）以pLCRSTP逆转录病毒上清感染原代大鼠胰岛细胞,以有限稀释法最终获得永生化胰岛β细胞克隆,LT-β;以phTERT-I-GTKlox逆转录病毒上清感染LT-β（P4）,以有限稀释法最终获得永生化胰岛β细胞克隆,LT-hTERT-β。对永生化β细胞LT-β、LT-hTERT-β进行培养与传代,分别传至第20代。（5）以他莫昔芬诱导Cre-ER移入细胞核,将永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）中的永生化基因及Cre-ER基因自身切除,以更昔洛韦筛选,最终分别获得相应回复后β细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β。（6）分别以PCR、RT-PCR、Western blot、免疫荧光双标染色,在DNA、mRNA、蛋白水平,检测SV40LTAg、Cre-ER基因在永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）中的整合、表达与细胞内定位,以及在回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β中的彻底切除;以同法检测hTERT基因在永生化细胞LT-hTERT-β（P20）中的整合、表达与细胞内定位,以及在回复后细胞R-LT-hTERT-β中的彻底切除;激光共聚焦显微镜下观察永生化细胞LT-hTERT-β（P20）、回复后细胞R-LT-hTERT-β中EGFP的表达。（7）永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）及回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β的功能及致瘤性的研究:以MTT比色法测定细胞生长率;以葡萄糖刺激的胰岛素释放试验检测其胰岛素释放量及胰岛素释放指数;以半定量RT-PCR法检测其Pdx-1、生长抑素、胰高血糖素mRNA的表达;以免疫荧光双标染色法检测其胰岛素、Pdx-1的表达及细胞内定位;以染色体核型分析、平板克隆形成实验、裸鼠致瘤性实验检测其致瘤性。结果:（1）成功构建并鉴定可回复性永生化逆转录病毒载体phTERT-I-GTKlox,成功鉴定可回复性永生化逆转录病毒载体pLCRSTP的正确性。（2）成功分离纯化获得纯度、活率均较高的原代大鼠胰岛,该胰岛细胞群富含具有正常胰岛素、Pdx-1合成能力的胰岛β细胞。（3）成功获得稳定包装pLCRSTP逆转录病毒颗粒的包装细胞pLCRSTP-Phoenix A。（4）成功诱导获得两种永生化胰岛β细胞,LT-β及LT-hTERT-β。（5）以Cre-ER/LoxP系统成功切除永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）内的永生化基因及Cre-ER基因自身,获得两种回复后β细胞,R-LT-β及R-LT-hTERT-β。（6）分别检测到Cre-ER、SV40LTAg、hTERT基因在永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）内的稳定整合、表达以及各自在细胞内的准确定位;成功鉴定了Cre-ER、SV40LTAg、hTERT基因在回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内的彻底切除。永生化细胞LT-hTERT-β（P20）内成功检测到EGFP的稳定表达,回复后细胞R-LT-hTERT-β内检测不到EGFP的表达。（7）细胞生长率的测定:永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）生长增殖旺盛,与原代细胞相比,其细胞增殖速度均显著加快,群体倍增时间均显著缩短（P <0.01）;两种永生化细胞之间相比较,无统计学差异。回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β生长增殖有限,其群体倍增时间较永生化细胞显著延长（P <0.01）,与原代细胞之间相比无统计学差异。（8）葡萄糖刺激的胰岛素释放试验的检测:无论低糖、高糖条件下,永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）的胰岛素释放量均较低,回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β的胰岛素释放量均显著增高（P <0.01）;两种回复后细胞的胰岛素释放量与原代胰岛细胞相比,均无统计学差异。永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）的胰岛素释放指数均较低。回复后细胞R-LT-β的胰岛素释放指数较永生化细胞LT-β（P20）显著增高（P <0.01）,回复后细胞R-LT-hTERT-β的胰岛素释放指数较永生化细胞LT-hTERT-β（P20）亦显著增高（P <0.05）。两种回复后细胞的胰岛素释放指数与原代胰岛细胞相比,均无统计学差异。在低糖、高糖刺激下的胰岛素释放量以及胰岛素释放指数方面,两种永生化细胞之间相比较,两种回复后细胞之间相比较,均无统计学差异。（9） Pdx-1 mRNA的半定量RT-PCR结果:永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）内Pdx-1 mRNA表达量均较低。回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内Pdx-1 mRNA表达量虽然较原代细胞低（P <0.01）,但分别为原代细胞表达量的0.89与0.91倍,且与永生化细胞相比,均显著增高（P <0.01）。两种永生化细胞内Pdx-1 mRNA表达量相比较,两种回复后细胞之间相比较,均无统计学差异。（10）胰高血糖素、生长抑素基因mRNA的RT-PCR结果:无论永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）,或回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内,均未检测到胰高血糖素或生长抑素mRNA的表达。（11）回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内,胰岛素、Pdx-1均能正常表达,细胞内定位准确,与原代大鼠胰岛细胞内胰岛素、Pdx-1的表达相似。（12）染色体核型分析:永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）及回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β内,均为正常二倍体核型,未见异常核分裂相。平板克隆实验结果:回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β,均未见克隆形成。裸鼠致瘤性分析:回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β,移植处皮肤局部均未见肿块形成;移植处皮肤局部及相应各内脏的组织切片,均未见异常增生细胞。结论:（1）以“一步法”转染pLCRSTP（含SV40LTAg、Cre-ER）成功获得可回复性永生化胰岛β细胞LT-β,以“两步法”转染pLCRSTP（含SV40LTAg、Cre-ER）及phTERT-I-GTKlox（含hTERT）成功获得可回复性永生化胰岛β细胞LT-hTERT-β,此两种永生化β细胞均可在体外持续增殖、长期稳定传代。（2）以Cre-ER/LoxP系统成功切除永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）内的永生化基因及Cre-ER基因自身,成功获得相应回复后β细胞:R-LT-β及R-LT-hTERT-β。（3）回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β,其胰岛素的合成及分泌功能较永生化状态下的细胞显著增高,与原代胰岛细胞一致;其Pdx-1 mRNA的表达量较永生化细胞显著增高,分别为原代细胞表达量的0.89与0.91倍;未见胰高血糖素、生长抑素mRNA的表达,未发现致瘤性,具有良好的表型及功能。（4）在细胞生长率,低糖、高糖刺激下的胰岛素释放量与胰岛素释放指数,Pdx-1 mRNA表达量方面,两种永生化细胞LT-β（P20）、LT-hTERT-β（P20）之间,两种回复后细胞R-LT-β、R-LT-hTERT-β之间,未发现差异。
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