论文摘要
现有的研究发现,抑郁症动物的部分脑区结构发生改变,尤其是海马神经元损伤（如CA3锥形神经元的萎缩）和齿状回神经元再生降低;对抑郁症患者进行的相关检查也得到相似结果。抗抑郁药物可以通过激活神经可塑性相关的胞内信号转导途径,逆转抑郁症引起的病理改变。细胞骨架是一个复杂的网络系统,包括微管、微丝和中间纤维。细胞骨架的改变与神经突起生长、突触形成等神经形态学变化密切相关,而神经元形态学的改变可能是细胞内外信号转导通路改变的最终结果。尽管这些研究提示抑郁症的发生可能与细胞骨架蛋白的变化有关,但迄今为止,其具体的作用机制尚未揭晓。本研究首先探讨了微管与抑郁症和抗抑郁剂治疗之间的关系,然后分别观察了抑郁症发生和治疗时神经元、神经胶质细胞的细胞骨架变化,旨在探讨细胞骨架及其相关信号转导通路的表达变化是否与抑郁症的发生以及抗抑郁治疗相关,为阐明细胞骨架在抑郁症病理生理机制中的作用提供实验证据。1、微管稳定性对大鼠行为学以及抗抑郁剂作用的影响微管是细胞骨架的重要组成成分,对于细胞结构的维持以及物质的运输发挥重要作用。秋水仙碱是微管特异性的解聚剂,可以特异性地与微管蛋白二聚体的β-微管蛋白紧密结合,减少自由状态的微管蛋白,阻止其它微管蛋白分子组装到微管体,从而抑制微管的聚合;紫杉醇是从紫杉中提取的微管特异性稳定剂,可以与微管蛋白以1:1的比例结合,能促进微管的装配并稳定已形成的微管,抑制微管二聚体的解聚。本实验通过海马微量注射秋水仙碱或者紫杉醇干扰海马细胞微管的稳定性,探讨微管在抑郁症的发生和抗抑郁剂的治疗过程中的作用。实验分组:秋水仙碱溶剂对照（海马微量注射溶剂）+生理盐水或者药物（腹腔注射或灌胃）;秋水仙碱（海马微量注射秋水仙碱）+生理盐水或者药物（腹腔注射或灌胃）;紫杉醇溶剂对照（海马微量注射溶剂）+生理盐水或者药物（腹腔注射或灌胃）;紫杉醇（海马微量注射紫杉醇）+生理盐水或者药物（腹腔注射或灌胃）。成年Wistar雄性大鼠海马齿状回双侧微量注射秋水仙碱（0.7μg/μL,2μL/侧）或者紫杉醇（0.7μg/μL,2μL/侧）或者相应的溶剂对照后,观察对其行为学的变化以及对抗抑郁剂作用的影响。（1）大鼠海马微量注射秋水仙碱（或紫杉醇）后给予去甲丙咪嗪（DMI,30mg/kg,i.p.）,术后7天,开场活动提示海马注射秋水仙碱（或紫杉醇）对大鼠的开场活动没有明显的影响;术后9天,大鼠腹腔注射DMI （30mg/kg）,观察强迫游泳模型上各组行为学的变化。结果显示,溶剂对照大鼠腹腔注射DMI后可以导致大鼠强迫游泳的不动时间明显缩短（P<0.05,溶剂对照大鼠腹腔注射生理盐水组比较）;大鼠海马微量注射秋水仙碱（或紫杉醇）对其强迫游泳不动时间没有明显的影响（与各自溶剂对照大鼠腹腔注射生理盐水组比较）,而大鼠海马注射秋水仙碱（或紫杉醇）后腹腔注射DMI对强迫游泳不动时间没有明显的影响（与海马注射秋水仙碱（或紫杉醇）后腹腔注射生理盐水组比较）。（2）大鼠海马微量注射秋水仙碱（或紫杉醇）后第10天开始慢性给予氟西汀（FLU,10mg/kg,i.g.）15天,通过观察新奇抑制摄食、强迫游泳等行为学变化来探讨微管稳定性与抗抑郁剂长期效应的关系。结果显示,大鼠海马微量注射溶剂对照后慢性给予FLU可以导致新奇抑制摄食的潜伏期明显缩短（P<0.05,与溶剂对照大鼠腹腔注射生理盐水组比较）;大鼠海马微量注射秋水仙碱（或紫杉醇）导致新奇抑制摄食潜伏期明显延长（P<0.05,与相应的溶剂对照大鼠腹腔注射生理盐水组比较）;大鼠海马注射秋水仙碱后长期给予FLU也可以导致摄食潜伏期明显延长（P<0.05,与溶剂对照大鼠腹腔注射生理盐水组比较）,却不能逆转秋水仙碱海马注射引起的摄食潜伏期的延长;而紫杉醇海马注射后长期给予FLU,对摄食潜伏期没有显著性影响（与紫杉醇海马注射大鼠腹腔注射生理盐水组比较）。在大鼠强迫游泳实验中,溶剂对照大鼠给予FLU后可以导致大鼠强迫游泳的不动时间明显缩短（P<0.01,与溶剂对照大鼠腹腔注射生理盐水比较）,而秋水仙碱（或紫杉醇）+生理盐水和秋水仙碱（或紫杉醇）+FLU对大鼠强迫游泳的不动时间没有明显的影响（与相应的溶剂对照大鼠腹腔注射生理盐水比较）,二者之间也没有显著性差异。2、抗抑郁药对慢性温和应激大鼠海马微管相关蛋白的调节微管是由微管蛋白构成的高度活动的多聚体,微管聚合、解聚主要受微管相关蛋白（microtubule -associated protein,MAPs）的调控,MAPs可以与微管结合,参与微管稳定性的调节。目前研究最为广泛的是微管相关蛋白-2 （microtubule -associated protein 2,MAP-2）和Tau蛋白。MAP-2是神经细胞骨架中分布最广泛的蛋白之一,参与突起生长和突触可塑性过程,在神经发育和神经可塑性过程中发挥重要作用,但MAP-2与抑郁症的关系至今仍不明。MAP-2可分为两大类:一类是高分子MAP-2,包括MAP-2A和MAP-2B,分子量分别为280和270kDa;另一类为低分子MAP-2,包括MAP-2C、MAP-2D和MAP-2E,分子量分别为70～75kDa。磷酸化MAP-2与树突的形成和突触激活相关。本研究中,所采用的磷酸化抗体是AP-18,该抗体只能识别Ser136磷酸化后的MAP-2A/B/C。大鼠慢性温和应激模型可以相对真实地模拟抑郁病人的某些病因和症状,目前被广泛地应用于抑郁症的病理生理机制和抗抑郁药物作用机制研究。大鼠经过慢性温和刺激之后,蔗糖饮水量下降,自发活动减少,而氟西汀伴随给药可以逆转这些变化。本实验免疫组织化学研究显示,慢性应激可以导致大鼠海马（p）-MAP-2表达明显降低,CA1区、齿状回部位更加明显。伴随给予氟西汀（FLU, 10mg/kg,每日一次）可以逆转这些变化。Western blot研究进一步证实,慢性应激大鼠海马（p）-MAP-2尤其是低分子量（p）-MAP-2C表达明显降低,而同时伴随给予氟西汀可以提高其表达水平。然而,慢性应激对于另外一种微管相关蛋白Tau蛋白表达没有影响。MAP-2受多种蛋白激酶与磷酸酶的调控,其中细胞外信号转导激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）是调节其磷酸化最重要的蛋白激酶之一,慢性应激可以导致pERK/ERK表达明显降低,而伴随给予氟西汀则可以逆转这种变化;原代海马神经元暴露于MEK的阻断剂（PD98059,10～20μmol/L）可以显著降低p-ERK的水平,同时浓度依赖性的降低p-MAP-2C的表达,但对p-MAP-2A没有显著性影响;在形态学上则表现为PD98059可以导致原代神经元突起长度的缩短。3、抗抑郁药对慢性温和应激大鼠海马胶质纤维酸性蛋白的调节中间纤维（intermediate filaments,IF）是细胞骨架的重要组成之一,是最稳定的细胞骨架成分之一,它主要起支撑作用,使细胞具有张力和抗剪切力。中间纤维在细胞中围绕着细胞核分布,成束成网,并扩展到细胞质膜,与质膜相连结。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）是星形胶质细胞特有的一种中间纤维,GFAP丝通过与细胞核膜、细胞膜之间的相互作用来加强骨架蛋白、维持细胞形状。星形胶质细胞是中枢神经系统数量最多的一种细胞,始终伴随着神经元的整个发育过程,在突触传递、神经组织修复、神经内分泌过程中发挥重要作用。在抑郁症发生时,星形胶质细胞的细胞骨架蛋白发生怎样的改变值得深入探讨。星形胶质细胞重要功能之一是可以合成和释放多种神经营养因子,其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）对于调节神经元生长、结构维持和神经可塑性发挥重要作用。本研究结果显示,慢性应激可以导致GFAP的表达显著下降,继而引起VEGF的表达降低,抗抑郁剂氟西汀可以逆转这些变化。体外研究发现,VEGF（10～20ng/mL）具有保护皮质酮（100μmol/L）损伤的海马神经元/海马神经前体细胞,促进神经前体细胞增殖的作用。通过以上研究,本文得到如下结论:1)大鼠海马微管稳定性被破坏后可以导致动物产生抑郁样行为,取消抗抑郁剂的急、慢性效应;2) MAP-2C在成年大鼠海马中也有表达;慢性应激可以导致大鼠海马（p）-MAP-2A/C以及调节MAP-2磷酸化的主要激酶p-ERK表达明显降低,抗抑郁剂氟西汀可以逆转这种变化;p-ERK是调节MAP-2C磷酸化的重要激酶之一;MAP-2C对于神经突起生长发挥重要作用。3)慢性应激可以导致大鼠海马中间丝蛋白GFAP的表达显著下降,抗抑郁剂氟西汀可以逆转这些变化;VEGF可以保护皮质酮损伤的海马神经元/海马神经前体细胞,促进神经前体细胞增殖;慢性应激导致的GFAP表达低下所引起的VEGF下调很可能参与抑郁症的发生。通过这些研究可以认为,细胞骨架的变化与抑郁症的发生以及抗抑郁治疗之间存在密切关系,以上结论未见文献报道。