论文摘要
苯系化合物为一类芳香族化合物,多为无色至浅黄色透明、易挥发的油状液体,具有强烈芳香气味,主要包括苯（Benzene）、甲苯（Toluene）、二甲苯（Xylene）等。苯系化合物多引起骨髓抑制及免疫系统抑制,主要产生血液毒性,可导致细胞及基因毒性。它可产生多种生物学效应,引起造血细胞凋亡增多、肝细胞及祖细胞复制增殖。抑制细胞因子分泌,影响T淋巴细胞的功能及外周血中亚群的改变。引起外周血血象改变,淋巴细胞及红细胞减少,引起微核。导致细胞凋亡、突变、细胞复制,引起DNA断裂,致淋巴细胞结构及其它方面染色体畸变,染色体损伤,非整倍体改变、染色体缺失、染色体易位等。苯进入人体,首先输入肝,在相关酶的作用下,活化代谢,其代谢产物及中间产物随即分布至血液、肾脏、脾脏、胸腺、骨髓等造血器官,作用于淋巴细胞和骨髓细胞,经过对染色体损害,代谢产物可引起血液疾病及癌样变。它可引起再障贫血,引起急性髓性白血病、血管瘤、骨髓异常增生综合症、腺淋巴瘤、慢性淋巴瘤、慢性白血病等造血器官肿瘤,苯亦可导致多器官肿瘤。苯及其代谢物选择性作用于某些非致死性染色体,端粒是苯的敏感作用位点及检测的选择点。针对苯的遗传毒性、染色体损伤、及肿瘤建模的研究已经多见。苯中毒的研究已从染色体改变深入到基因水平研究。端粒酶是逆转录酶,由RNA和蛋白质组成的核糖蛋白酶,它主要有三个组成成分:端粒酶RNA组分（telomerase RNA component, TERC）、端粒酶相关蛋白（telomerase-associated protein, TELPI）和端粒酶逆转录酶催化蛋白亚单位（telomerase reverse transcriptase, TERT）。端粒酶能合成新的端粒DNA,添加到染色体末端,来补偿端粒的丢失、粘连、重组阻止端粒的缩短,使细胞逃脱程序性死亡。在大多数体细胞和正常组织中,端粒酶活性不表达或低水平表达,生殖细胞、胚胎细胞、造血干细胞、骨髓细胞、肿瘤、癌组织中高表达。它使端粒,染色体末端重复DNA系列呈帽子结构维持染色体稳定性,与细胞衰老、分化、肿瘤形成有关,维持长度并跨过生物钟,进行分裂,细胞衰老、凋亡、永生化过程中激活端粒酶高表达,引起肿瘤和癌症,并且表达水平同肿瘤恶化程度正相关。端粒酶激活是肿瘤形成的必经途径,它是肿瘤具特异性和普遍性的效应标志物和早期分子生物学标志物。硒具有营养作用,在体内发挥消除自由基、抗氧化等作用。营养剂量硒具有激活端粒酶活性、延长端粒、延长细胞寿命的功能。它在肿瘤的发生发展过程中起预防作用,它可以抗衰老、抑制肿瘤、癌症。苯对细胞产生毒性,我们采用动物实验构建模型对其进行毒性评价。选用健康昆明小鼠,随机分成几组,分别设不同剂量组用苯对其进行染毒,并设不同剂量苯联合硒组进行处理,同时设阴性对照和试剂对照。染毒后观察变化,收获外周血淋巴细胞,采用端粒重复扩增分析法（telomere repeat amplification protocol assay, TRAP）法检测其端粒酶活性。分析苯及硒对淋巴细胞端粒酶活性的影响,观察两者的相关性。鉴于此,我们研究了苯对小鼠淋巴细胞端粒酶活性的毒性影响及硒的调节作用,进一步了解苯致肿瘤及癌症的机制,旨在从端粒系统获得新的苯暴露早期效应生物学标志物和易感性标志物。第一部分苯对小鼠淋巴细胞端粒酶活性的影响及硒的调节作用目的:本部分通过研究苯对小鼠淋巴细胞端粒酶活性的影响及硒的调节作用,评价端粒酶作为生物标志物对苯致癌症的分子机制的影响,旨在获得新的苯暴露早期效应生物学标志物和易感性标志物。方法:选择68周龄的健康雄性昆明小鼠,25-30g左右,40只随机分成8组,每组5只。分别设100.0 mg/kg苯、200.0 mg/kg苯及400.0 mg/kg苯染毒组,200.0 mg/kg苯+ 0.75 mg/kg亚硒酸钠、200.0 mg/kg苯+ 1.5 mg/kg亚硒酸钠及200.0 mg/kg苯+ 3.0 mg/kg亚硒酸钠处理组,阴性对照组及试剂对照组。对小鼠采用腹腔注射染毒,连续5天,末次染毒48h后,眼球摘除取外周血,分离淋巴细胞。用TRAP-ELISA法定量分析淋巴细胞端粒酶活性,在前引物P1-TS的作用下,端粒酶先以自身为模板合成端粒DNA,然后在前引物P1-TS和后引物P2作用下对TTAGGG结构进行PCR特异性扩增。取5μl PCR产物进行变性,再与地高辛标记的探针进行杂交,加入到生物素标记的微孔板中,最后加入TMB底物,在450nm和690nm波长处读取溶液的OD值,A450-A690的值即我们的端粒酶活性值。比较不同组间的端粒酶活性差异,分析苯对端粒酶的毒性作用和硒的调节作用,利用统计软件分析实验数据。结果:阴性对照和试剂对照呈现微弱的端粒酶活性表达,活性值均在正常范围内。各剂量苯处理组与阴性对照和试剂对照相比,端粒酶活性阳性,均值范围均升高,其中100.0 mg/kg苯组有统计学差异（P<0.01）,说明苯刺激了端粒酶的表达。与阴性对照和试剂对照相比,各剂量苯联合硒作用组端粒酶活性均增高,其中200.0 mg/kg苯+ 0.75 mg/kg亚硒酸钠组有显著性差异（P<0.001）,三组活性值均为阳性。同时,与相应的200.0 mg/kg苯组相比,端粒酶活性均增加,说明硒激活了端粒酶活性。结论:本实验中,活体不同浓度苯作用均增高端粒酶活性表明小鼠淋巴细胞得到激活和增殖,端粒酶可能是苯刺激淋巴细胞的一种敏感的早期效应标志物。硒可以上调小鼠淋巴细胞端粒酶活性。说明端粒酶是潜在的苯暴露致肿瘤的早期效应生物标志物。第二部分荧光定量RT-PCR快速检测重要肠道病毒的研究目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测重要肠道病毒的方法。方法:从GeneBank下载相应肠道病毒的基因系列,利用TaqMan技术,根据肠道病毒基因的相对保守序列参考国外文献分别设计一对共引物及相应的TaqMan探针。首先检测荧光定量RT-PCR的特异性,以PolioⅠ、Ⅱ、Ⅲ、EV71、CA16和CA24标准株作为阳性标准,轮状病毒、诺沃克病毒为阴性标准,并设阴性对照。对反应体系及反应条件进行优化。其次建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,以EV71为标准株,用通用引物构建质粒标准品,测定OD值定量后,十倍倍比稀释标准品（108-104拷贝/μl）并用建立的方法构建定量标准曲线。同时,以EV71为标准株进行病毒效价滴定后作为参考株,根据TCID50十倍倍比稀释至8个浓度,并设置阴性对照用建立的方法构建灵敏度标准曲线。最后,收集2006年深圳市疑似肠道病毒感染的病人粪便标本共69份,用通用引物进行传统的RT-PCR检验,再用荧光定量RT-PCR进行检验,验证其应用价值。结果:所有对照经我们建立的体系检验,该方法具有高度的特异性,PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ、EV71、CA16和CA24阳性标准均观察到荧光信号增强,轮状病毒、诺沃克病毒和阴性对照均未观察到荧光信号增强,说明无假阳性结果。阳性标准和阴性标准间无交叉反应。我们用EV71标准株构建的质粒标准品,建立的定量标准曲线最低检测限为105拷贝/μl,曲线斜率为-3.474,在Y轴截距为53.67,R2=0.999,PCR扩增效率为94%。用EV71标准株进行病毒效价滴定后的TCID50,建立了灵敏度标准曲线,本体系检测到的最低浓度值为5.0 TCID50,曲线斜率为-3.230,在Y轴截距为16.36,R2=0.991,PCR扩增效率为104.0%。说明我们建立的标准曲线各个浓度的相关系数非常好,PCR反应对模板的扩增很完全。临床标本验证中,89份肠道病毒疑似病例的粪便标本用建立的荧光RT-PCR和传统的RT-PCR进行检测,普通RT-PCR检出56份手足口病阳性,检出率为62.92%,我们建立的荧光RT-PCR检出72份阳性结果,检出率为80.9%,荧光RT-PCR检出率显著高于普通RT-PCR,两者符合率为79.78%。说明荧光RT-PCR可以用于日常疑似肠道病毒感染的临床标本的筛检工作。结论:我们成功建立了快速检测重要肠道病毒共引物的荧光定量RT-PCR方法,该方法具有敏感性高、特异性好、效率高、稳定性好、准确、简单等优点,筛检标本检出率及符合性好,可以作为肠道病毒的快速检测方法,用于疑似肠道病毒感染的日常临床标本筛检工作。