论文摘要
血吸虫病是一种危害人类健康的重要的地方性传染病。血吸虫之所以能长期寄生于人体内,主要的原因是血吸虫成虫和虫卵的排泄分泌抗原能够诱导宿主的免疫系统发生免疫反应类型的偏移,由感染初期的具有抗血吸虫感染功能的Th1型保护性免疫反应转变为有利于血吸虫生长发育的Th2型免疫反应。血吸虫排泄分泌抗原来源于血吸虫虫体或虫卵,与宿主免疫系统直接接触,是活体血吸虫存在于宿主体内的直接证据,检测这些虫源性分子或针对这些分子的特异性抗体具有重要的诊断意义。同时,研究这些分子的功能也将有助于阐明血吸虫感染免疫机制,对于发展高效疫苗,免疫佐剂以及发展自身免疫性疾病的预防措施同样具有重要的促进作用。已有的研究表明曼氏血吸虫的虫卵蛋白IPSE（IL4-inducing principle of S.mansoni eggs）分子在虫卵中含量丰富,是一种外分泌糖蛋白。以此抗原检测血吸虫病血清抗体,表现出高度的特异性和敏感性,具有较高的诊断价值和一定的疗效考核价值。同时该分子还是一种有效的免疫调节剂,能促进IL-4水平升高,增强Th2型免疫应答。对日本IPSE样分子的研究尚未见报道,本研究根据曼氏血吸虫的IPSE基因DNA序列,人工合成IPSE基因,制备了具有天然功能活性的重组IPSE蛋白,为未来采用cDNA文库筛选的方法发现日本血吸虫IPSE样蛋白分子基因,发展新的血吸虫病诊断方法、免疫干预措施提供了条件。本研究包括如下三个部分内容:1.曼氏血吸虫虫卵IPSE基因合成与鉴定根据编码IPSE成熟肽基因的核苷酸序列设计14条末端互补的寡核苷酸片段（每条长50 bp）,并进行化学合成。以此14条寡核苷酸片段为引物进行Overlapping PCR,获得长度为417 bp的IPSE DNA片段。将合成的DNA片段插入到TA克隆载体pGEM-T中后进行DNA序列分析。测序结果显示合成的IPSE序列与天然基因序列完全一致,表明本研究的曼氏血吸虫虫卵IPSE基因合成获得成功。2.IPSE基因的原核表达质粒的构建及融合蛋白的表达将IPSE DNA片段定向克隆到表达载体pET32a（+）的硫氧还蛋白（Trx）序列下游,构建重组表达质粒IPSE/pET32a（+）。重组质粒IPSE/pET32a（+）转化进表达宿主菌E.coli BL21（DE3）中获得含此重组质粒的转化子菌株。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,转化子细菌能表达分子量约35.7kDa的蛋白分子,与预计Trx-IPSE融合蛋白分子量大小相符。3.Trx-IPSE融合蛋白纯化、复性与功能研究大量制备表达产物,用镍螯合亲和层析胶在变性条件对该重组融合蛋白进行纯化,获得纯化重组Trx-IPSE融合蛋白。用大量PBS对变性融合蛋白进行透析,获得部分复性的可溶性重组Trx-IPSE融合蛋白。免疫印渍分析表明,无论变性还是复性的Trx-IPSE融合蛋白均能够被抗血吸虫天然IPSE蛋白的IgG抗体所识别;以羊抗人IgE为二抗,显示融合蛋白Trx-IPSE能与健康人血清中IgE抗体非特异性结合,说明重组表达的IPSE蛋白同样具有与IgE抗体结合的能力。本研究成功地合成了曼氏血吸虫虫卵IPSE蛋白基因,获得了具有与天然蛋白功能相似的重组IPSE蛋白,为下一步应用抗曼氏血吸虫IPSE蛋白抗体筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库,发现日本血吸虫类似基因,发展新的血吸虫病诊断方法及免疫干预措施奠定了基础。
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相关论文文献
- [1].曼氏血吸虫虫卵蛋白IPSE基因合成、表达及特性分析[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2010(02)