缺氧脂肪细胞条件培养基造成骨骼肌细胞胰岛素抵抗

论文摘要

研究目的：脂肪组织缺氧是肥胖的早期表现,与巨噬细胞浸润和局部炎症相关。我们研究在缺氧环境中培养的脂肪细胞,释放促炎因子对巨噬细胞迁移以及骨骼肌胰岛素作用的影响。方法：1.在21%O2,5%CO2（常氧）或1%O2,94%N2,5%CO2（缺氧）培箱中培养脂肪细胞,并提取条件培养基。2. Real-time PCR测定缺氧脂肪细胞的脂肪因子的mRNA水平。3. ELISA测定脂肪细胞条件培养基CM-H中TNFa、IL-6、MCP-1和脂联素的水平。4. Transwell系统观察缺氧培养的脂肪细胞对巨噬细胞的趋化作用。5.偶联抗体的吸光度分析法测定骨骼肌中GLUT4转位。6. Western Blot法测定胰岛素信号分子的磷酸化水平。7.热灭活CM-H后检测对骨骼肌细胞GLUT4转位的影响。8.中和抗体中和CM-H中MCP-1、IL-6后检测对骨骼肌细胞作用的影响。9.加入AMPK抑制剂Compound C后检测其对骨骼肌细胞作用的影响。结果：1.3T3-L1脂肪细胞缺氧后缺氧诱导因子HIFla和葡萄糖转运子GLUT1的蛋白表达升高。2.缺氧脂肪细胞的TNFa, IL-6和MCP-1的mRNA表达增加,而脂联素的mRNA表达降低。3.CM-H中的TNFa, IL-6和MCP-1浓度增加,而脂联素浓度降低。4.在Transwell的共培养系统中,缺氧脂肪细胞比常氧脂肪细胞募集更多巨噬细胞。用中和抗体中和共培养系统中的MCP-1抑制巨噬细胞的迁移。5.CM-H导致C2C12肌管基础状态葡萄糖转运子GLUT4转位增加而胰岛素刺激的GLUT4转位减少。6.CM-H导致C2C12肌管中介导胰岛素调节的GLUT4外排的两个关键信号分子Akt和AS160磷酸化水平明显降低。CM-H磷酸化JNK和S6K,并增加C2C12肌管细胞的IRS1丝氨酸磷酸化水平。7.热灭活CM-H中的细胞因子逆转其对肌细胞GLUT4转位的影响。8.在CM-H中加入IL-6中和抗体,部分逆转条件培养基造成的骨骼肌细胞基础状态GLUT4转位及胰岛素刺激的GLUT4转位增加。9.在CM-H中加入AMPK抑制剂Compound C,部分逆转条件培养基对骨骼肌细胞基础状态GLUT4转位及胰岛素刺激的GLUT4转位增加。10.在CM-H中加入MCP-1中和抗体,部分逆转条件培养基造成的骨骼肌细胞胰岛素刺激的GLUT4转位减少。结论：1.缺氧可以使脂肪细胞TNFα, IL-6和MCP-1表达与分泌增加,脂联素的表达与分泌降低。2.升高的趋化因子MCP-1可以促进巨噬细胞向脂肪细胞迁移。3.CM-H造成骨骼肌细胞膜上基础状态GLUT4转位增加而胰岛素刺激的转位减少,及骨骼肌细胞胰岛素信号通路受损。4.热灭活可以逆转CM对肌细胞GLUT4的转位影响。.5.IL-6可能通过AMPK磷酸化既参与CM-H造成的骨骼肌细胞基础状态GLUT4转位增加和胰岛素刺激的转位增加。6.MCP-1参与CM-H造成的骨骼肌细胞胰岛素刺激的转位减少。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、缺氧处理脂肪细胞,制备条件培养基
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 细胞
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要溶液
• 1.1.4 主要仪器、设备
• 1.1.5 实验方法及流程
• 1.2 结果
• 1.2.1 3T3-L1脂肪细胞的培养与分化
• 1.2.2 缺氧升高脂肪细胞HIF-1α和GLUT1表达
• 1.2.3 缺氧增加TNFα,IL-6和MCP-1的mRNA及蛋白的表达,降低脂联素的mRNA及蛋白的表达
• 1.3 讨论
• 1.3.1 缺氧脂肪细胞可以造成脂肪细胞缺氧应答基因表达改变
• 1.3.2 缺氧调节TNFα,IL-6、MCP-1和脂联素的表达
• 1.4 小结
• 二、脂肪细胞募集巨噬细胞
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 主要仪器、设备
• 2.1.5 实验方法及流程
• 2.2 结果
• 2.2.1 缺氧脂肪细胞促进巨噬细胞迁移
• 2.2.2 缺氧脂肪细胞条件培养基促进巨噬细胞迁移
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、缺氧脂肪细胞条件培养基对骨骼肌细胞胰岛素作用的影响
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 细胞
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液
• 3.1.4 仪器设备
• 3.1.5 实验方法及流程
• 3.2 结果
• 3.2.1 缺氧脂肪细胞条件培养基造成肌肉细胞GLUT4转位减少
• 3.2.2 缺氧脂肪细胞条件培养基造成肌肉细胞胰岛素信号通路异常
• 3.2.3 脂肪细胞分泌的IL-6和MCP-1对肌肉细胞中基础和胰岛素刺激的GLUT4转位的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 脂肪细胞条件培养基调节肌细胞胰岛素信号
• 3.3.2 脂肪细胞释放的IL-6和MCP-1调节肌肉细胞中基础和胰岛素刺激的GLUT4转位
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 缺氧与炎症、胰岛素抵抗的关系
• 综述参考文献
• 致谢