论文摘要
目的 定位于人类染色体9p21 的INK4a/ARF 基因位点,所编码的两个蛋白质p16INK4a和p14ARF分别在目前所发现的两条关键细胞周期调控通路—pRb 通路和p53 通路中发挥着重要的调节作用。本研究通过阳离子脂质体转染,将这两个周期调控基因同时导入INK4a/ARF 基因位点缺失的人肺腺癌细胞系A549 中,恢复蛋白p16INK4a和p14ARF在该细胞系中的表达,研究其对A549 细胞生物学行为的影响和转染前后对5 种常用肺腺癌化疗药物敏感性的影响。方法1. 利用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将含有人全长野生型INK4a/ARF 基因的真核表达重组质粒pcDNA3-p16INK4a和pcDNA3-p14ARF导入该基因位点缺失的人肺腺癌A549 细胞系中,并确定所编码的两种蛋白p16INK4a和p14ARF同时在A549 细胞中稳定表达。2. 经G418 筛选,并利用RT-PCR、免疫细胞化学和Western blotting 检测p16INK4a和p14ARF蛋白的表达,筛选出同时表达p16INK4a和p14ARF蛋白的细胞株并命名为A549-p16INK4a-p14ARF,空白对照质粒转染后命名为A549-vector。3. 在设立空白组和空质粒转染组的情况下,利用细胞记数、克隆形成实验、流式细胞技术进行了转染前后细胞增殖曲线、克隆形成率、周期分布、凋亡指数等指标的检测和分析。4. 选择5 种不同作用机制的常用肺腺癌化疗药物盐酸阿霉素（ADM）、顺铂（CDDP）、拓朴替康（TPT）、紫杉醇（Taxol）、诺维本（NVB）,作用于转染前后的细胞,利用MTT 法,测定各种不同药物的50%抑制浓度（IC50）,并测定在IC50 药物浓度作用下转染细胞的凋亡指数,研究转染对A549 细胞化疗敏感性的影响。结果1. INK4a/ARF 基因转染后的细胞应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western blotting检测,提示有目的蛋白表达,说明转染成功。
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