论文摘要
蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白翻译后加工,是生物体内重要的共价修饰方式之一。它由两个作用相反的酶系一磷酸酶和激酶进行调控。其中,蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶,催化多种蛋白质上Ser/Thr磷酸化,在跨膜信号传递过程中起着重要作用。已有的研究表明,磷酸化作用对UGT酶的活性以及底物的选择性都会产生重要的影响。对于多数UGT1A亚型而言,只有在一定磷酸化修饰下,蛋白酶才表现出较好的底物催化活性,且这种磷酸化作用多数受蛋白激酶C（PKC）的调控。在此基础上,本课题从分子水平对磷酸化与UGT1A3活性的关联机制进行探讨。应用分子生物学相关技术,通过有完备翻译后修饰功能的Bac-to-Bac昆虫系统建立高效表达人UGT1A3的转基因细胞系；采用磷酸化抑制剂姜黄素和钙感光蛋白-C分别作用于Sf9细胞,考察表达得到的UGT1A3重组酶对槲皮素的代谢变化,从而探究磷酸化对UGT1A3活性的调控,以及这种调控是否是通过PKC引起的。1人UGTlA3蛋白在Sf9细胞中的表达、活性鉴定及亲和纯化目的通过杆状病毒-昆虫表达系统重组表达人UGT1A3,对其活性进行鉴定,并建立检测底物槲皮素的含量测定方法,为后续考察代谢变化提供可靠的HPLC分析方法；摸索UGT1A3亲和纯化的条件,为进一步质谱分析磷酸化奠定基础。方法从实验室已保存的DH10Bac-pFastbacTM1-1A3菌中提取重组粘粒（Bacmid-UGT1A3）,转染Sf9细胞,产生重组杆状病毒；得到的较高滴度的病毒液再次感染细胞以获得UGT1A3重组酶。采用、vestern-blot检测蛋白质水平上UGT1A3的表达。以槲皮素为底物,HPLC方法检测重组酶的活性,并进行方法学考察；同时测定了UGT1A3对槲皮素的代谢动力学参数。由于构建时在蛋白的3’端加入了6×His的组氨酸标签,因此运用镍柱亲和色谱方法对细胞中UGT1A3重组酶进行亲和纯化。结果得到的高滴度病毒液（34.4μg·mL-1）感染Sf9细胞,利用western blot检测到60kD左右有清晰条带出现,与UGT1A3预期大小相符,表明目的蛋白在细胞中得到良好表达。以槲皮素为底物,对重组酶的代谢活性进行分析,HPLC检测到4个新色谱峰,经p-葡萄糖醛酸水解酶作用后4个峰消失,确定其为二相葡萄糖醛酸结合产物。所建立的HPLC方法对槲皮素5～200μmol·L-1内线性关系良好（r=0.9999）,检测下限为1.25μmol·L-1 （S/N3）,定量下限为5μol·L-1 （S/N>10, RSD=6.99%,n=5）,方法回收率达99.1%-103.5%,日内,日间RSD分别<2.5%和<8%。另测得UGT1A3催化槲皮素的Km为（62.95±13.16）μmol·L-1, Vmax为（284.5±24.35） nmol-min-1·g-1,清除率Vmax/Km为4.52ml·min-1·g-1 UGT1A3经镍柱亲和纯化和超滤作用后,SDS-PAGE得到相对较纯的目的蛋白条带。结论Sf9细胞表达得到的UGT1A3重组酶对槲皮素具较好催化活性,且建立的HPLC分析方法灵敏、准确、专属性强,可用于槲皮素在细胞中的含量测定。亲和纯化得到UGT1A3重组蛋白,可进一步用于质谱分析。2激酶抑制剂对人UGTlA3活性调控作用目的研究泛激酶抑制剂姜黄素和蛋白激酶C（PKC）特异性抑制剂钙感光蛋白-C对Sf9细胞表达得到的UGT1A3重组酶的活性调控作用。方法以MTT法分别评价姜黄素和钙感光蛋白-C对Sf9的细胞毒性。在不引起细胞毒性的浓度范围内,将不同浓度姜黄素或钙感光蛋白-C与UGT1A3重组酶细胞破碎液孵育,以考察抑制剂本身是否对酶活性产生影响。在此基础上,将两种抑制剂分别作用于表达重组酶的细胞,收集的蛋白样品通过western blot和代谢孵育分别考察UGT1A3的表达量变化和对槲皮素代谢活性变化。另外,考察在底物槲皮素不同孵育浓度下,抑制剂姜黄素或钙感光蛋白-C对重组UGT1A3蛋白的活性影响。结果MTT试验表明,在各自处理条件下,姜黄素和钙感光蛋白-C在终浓度分别低于50μmol·L-1和1000nmo1·L-1时对细胞均无明显毒性。孵育实验显示,在25μmol·L-1或1 OOOnmol·L-1浓度范围之内,姜黄素或钙感光蛋白-C的加入并未改变UGT1A3对底物槲皮素的代谢,各样品活性均维持在95%或93%以上,表明这两种抑制剂本身均对UGT1A3代谢活性没有影响。经不同浓度抑制剂（姜黄素：1,5,15,25μmol·L-1；钙感光蛋白C:1,10,50,125,250,500,1000nmol·L-1）处理的细胞破碎后,western blot分析发现目的蛋白表达量未发生明显变化,而其对底物槲皮素的代谢活性呈现抑制剂浓度依赖性降低；在25μmol·L-1姜黄素或500 nmo1·L-1钙感光蛋白-C作用下,UGT1A3对槲皮素的活性分别降到对照的41.6%和21.9%。以25μmol·L-1的姜黄素和500 nmol·L-1的钙感光蛋白-C分别作用于瞬时表达UGT1A3的Sf9昆虫细胞,细胞破碎液与不同浓度的底物槲皮素进行孵育。结果显示,在不同底物浓度（5-250μmol·L-1）下,两个抑制剂组的蛋白活性始终比相应阳性对照组活性低；且除了当槲皮素浓度为10μmol·L-1的情况例外,其他条件下,UGT1A3酶活性都对PKC特异性抑制剂钙感光蛋白-C具有更好的灵敏性。结论姜黄素作为公认的泛激酶抑制剂,它对UGT1A3活性的浓度依赖性抑制从一个方面说明Sf9细胞中表达得到的UGT1A3重组酶需经过磷酸化修饰才能获得较好活性,即UGT1A3活性受磷酸化机制的调控。而蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）的高特异性抑制剂钙感光蛋白-C也对UGT1A3呈现出浓度依赖性抑制作用,提示PKC很有可能参与了对UGT1A3的磷酸化调控作用。
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