hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的实验研究

论文摘要

目的用人骨形成蛋白-7真核表达质粒（pIRES2-EGFP-hBMP-7）转染Beagle犬骨髓基质细胞（BMSCs）,复合胶原膜BME-10X体外构建组织工程化复合物,移植修复犬慢性Ⅱ°根分叉病变,探讨hBMP-7基因修饰的BMSCs在牙周组织再生中的作用,为基因治疗与组织工程联合应用于牙周组织缺损再生治疗奠定基础。方法1.利用DNA重组技术,将hBMP-7片段克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,EcoRⅠ单酶切、PCR及序列分析鉴定获得的重组质粒;2.贴壁法培养Beagle犬BMSCs,体外应用脂质体进行基因转染,RT-PCR、免疫细胞化学染色及ELISA检测目的基因的转录和表达。3.体外基因转染后,观察细胞形态变化,MTT法描绘细胞的生长曲线,TUNEL和流式细胞技术检测细胞的凋亡,检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）及钙化结节等成骨细胞表型。4.转染目的基因的细胞与胶原膜BME-10X复合,通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、扫描电镜、透射电镜及组织学进行观察。5.人工构建5只Beagle犬慢性Ⅱ度根分叉病变模型,将转染目的基因的BMSCs与未转染BMSCs分别以1×107个/mL接种于胶原膜BME-10X,植入牙周缺损内,12周后取材作病理切片,H.E染色观察牙周组织再生情况,测量新生牙骨质长度百分比和新生牙槽骨面积百分比,结果进行统计学分析。结果1.hBMP-7被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中。2.通过脂质体介导成功地对Beagle犬BMSCs进行了pIRES2-EGFP-hBMP-7瞬时转染,24h后即可见到转染的部分细胞发出较强的绿色荧光,转染效率为17%-31%。RT-PCR、免疫组织化学染色和ELISA检测表明,hBMP-7在BMSCs中得到了有效表达。3.目的基因转染后细胞形态略有变化,增殖能力无明显改变,凋亡率无明显变化,碱性磷酸酶活性明显增高,骨钙素表达增强,钙化结节增大。4.转染细胞复合胶原膜后生长良好,24h细胞已贴附、伸展,并复层生长。透射电镜可见细胞与材料表面连接紧密,包膜部分增厚,形成类似半桥粒样结构。5.各实验组和对照组均可见不同程度的牙周组织再生,转染细胞复合胶原膜组和未转染细胞复合胶原膜组的新生牙槽骨面积百分比和新生牙骨质长度百分比与单纯材料组相比有明显增加（P<0.05）;转染细胞复合胶原膜组新生牙槽骨面积百分比与未转染细胞复合胶原膜组相互比较差异有显著性（P<0.05）;而其新生牙骨质长度百分比与之相比无显著性差异（P>0.05）。结论1.利用基因工程原理成功构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-hBMP-7。2.hBMP-7基因可在BMSCs中有效表达。3. hBMP-7基因转染可以加速BMSCs向成骨细胞表型转化,hBMP-7基因转染的BMSCs有望成为牙周组织工程理想的种子细胞。4. hBMP-7基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好,hBMP-7基因转染的BMSCs与胶原膜复合物有望应用于牙周组织工程。5. hBMP-7基因强化的组织工程技术是修复牙周组织缺损的一种较好的方法,有很好的临床应用前景。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 hBMP-7 真核表达质粒的构建及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 hBMP-7 基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达检测
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 hBMP-7 基因瞬时转染对Beagle 犬骨髓基质细胞生物学活性的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 hBMP-7基因转染的骨髓基质细胞与胶原膜BME-10X复合物的体外构建
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第五部分 hBMP-7 基因修饰的组织工程化复合物促进牙周组织再生的动物实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 综述 基因强化组织工程在牙周组织再生中的应用
• 致谢