与Smad4相互作用的新蛋白HP的鉴定及特性研究

论文摘要

转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）信号通路在细胞生长、分化、迁移和凋亡过程中具有很重要的作用。在此信号通路中,TGF-β先通过其受体磷酸化调节型Smad（receptor regulated Smad,R-Smad）,然后磷酸化的R-Smad与通用调节Smad（common-mediator Smad,co-Smad）形成复合物,复合物入核直接参与目的基因的调节,从而调控细胞的生长和分化。然而,在TGF-β信号途径中介导细胞生长抑制的Smad调节因子的研究甚少。Smad4在TGF-β信号转导途径中处于中枢地位。Smad4对恶性肿瘤的发生、发展及转移有重要作用。Smad4（260-514aa）能诱导大规模染色质结构伸展。这一区域可能通过与其它蛋白质的相互作用来发挥Smad4的转录调节功能。本研究以Smad4（260-514aa）为诱饵,用酵母双杂交技术从人乳腺cDNA文库中筛选与Smad4（260-514aa）相互作用的蛋白,分离到了与Smad4相互作用的未知蛋白质—HP,并探讨了HP基因及其表达蛋白的性质、HP的生物学功能、HP参与调节TGF-β信号通路的可能作用模式。HP基因及其表达蛋白的性质的初探。将分离得到的新基因进行克隆,成功得到了真核表达重组质粒pcDNA3-FLAG-HP。生物信息学分析发现HP含有21个补体调控蛋白（complement control protein,CCP）和两个半CCP序列元件。Western Blot分析显示HP在细胞裂解物及细胞培养上清液中都有表达。免疫荧光染色技术,通过对HP载体在转染MCF-7细胞后不同时间点表达过程的观察,验证了HP是分泌蛋白。通过Edman降解,最终分析得到HP N端前16个氨基酸的信号肽序列。体内外试验验证了HP与Smad4存在相互作用。应用免疫共沉淀试验检测,结果显示HP与Smad4在哺乳动物细胞内存在结合。通过GST沉淀检测,结果显示HP与Smad4在体外存在相互作用。上述结果验证了HP与Smad4在体内外存在相互作用。检测了HP的转录调节活性。HP以及HP的缺失突变体能以不依赖TGF-β的方式,不同程度地抑制3TP荧光素酶报告基因的转录。293T细胞中,HP增强TGF-β应答元件的c-Myc报告基因转录活性,同时抑制了PAI-1、P21报告基因转录活性。而在MCF-7细胞中,PAI-1、P21报告基因转录活性升高,c-Myc报告基因转录活性降低。这预示了HP调节TGF-β应答元件的报告基因转录活性具有细胞特异性。HP能以雌激素不依赖的方式抑制雌激素反应元件（estrogen response element,ERE）的转录活性,该结果表明HP参与调节的TGF-β/Smads信号转导与ER信号通路存在串话调节。将RNA干扰（RNA interference,RNAi）实验与活性实验相结合,发现抑制HP的表达后,MCF-7细胞中HP增强TGF-β应答元件的报告基因转录活性的功能也受到抑制。检测了HP的蛋白表达调节活性。通过G418抗性筛选后得到HP稳定转染细胞株HP-MCF-7。Western Blot检测,HP过量表达激活（周期依赖激酶抑制剂）P21、P15、P27、纤溶酶原激活剂抑制因子-1（plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1）、Smad4、BRCA1的表达;同时抑制促进细胞生长的c-Myc、c-jun、Rb、Bcl-2、c-fos的蛋白表达。此结果说明了HP具有蛋白表达调节活性,并且HP有可能作为一种抑癌蛋白,协同增强抑癌蛋白的表达,同时拮抗癌蛋白标志分子的表达。研究了HP的细胞学功能。流式细胞仪分析结果得出HP的高表达,使细胞生长阻滞在G2/M期。用结晶紫细胞生长曲线测定的方法检测表明MCF-7-HP的生长速度显著慢于MCF-7-149细胞。HP蛋白分泌表达24h,48h,72h都能不同程度地抑制乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞的生长;同时对正常人乳腺细胞、正常肺、肝细胞、正常成纤维细胞的生长以及SV40转化的人胚胎肾细胞抑制不明显。利用软琼脂实验检测HP使肿瘤细胞集落形成能力降低。探讨HP参与调节TGF-β信号通路的可能机理。收集用TβRⅡ受体抑制剂SB431542处理的稳定转染细胞株,Western Blot分析,不同剂量SB431542处理的细胞TGF-β下游基因的蛋白表达与对照相比没有明显差异。结果表明,分泌蛋白HP不是直接与膜上Ⅱ型受体结合,有可能是与胞外配体结合,以活化配体调节胞内下游信号的转导。上述研究结果表明,HP可能是TGF-β信号通路的一个新型调控因子,通过与Smad4相互作用而参与TGF-β信号通路的调控,进一步的深入研究将有助于了解TGF-β信号通路的调控机制。

论文目录

摘要

ABSTRACT

1.前言

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 引物合成及序列测定

2.1.2 菌株、细胞株

2.1.3 质粒

2.1.4 分子生物学工具酶

2.1.5 常用分子生物学试剂盒

2.1.6 细胞培养试剂

2.1.7 抗体

2.1.8 其它试剂

2.1.9 大型仪器

2.2 方法

2.2.1 载体的构建与鉴定

2.2.1.1 PCR扩增目的片段

2.2.1.2 酶切PCR产物和载体

2.2.1.3 连接

2.2.1.4 转化

2.2.1.5 重组子的筛选

2.2.1.6 测序

2.2.2 哺乳动物细胞的转染

2.2.3 Western Blot分析

2.2.4 Northern Blot分析

2.2.5 细胞中总RNA的提取及RT-PCR

2.2.6 蛋白的胞内定位检测

2.2.7 HP信号肽氨基酸序列测定

2.2.8 GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

2.2.9 His融合蛋白的诱导表达与纯化

2.2.10 HP多克隆抗体的制备

2.2.11 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）

2.2.12 GST沉淀（pull-down）分析

2.2.13 HP转录活性的测定

2.2.14 SiRNAs表达载体的构建

2.2.15 筛选稳定转染细胞株及单克隆化鉴定

2.2.16 细胞生长情况鉴定

2.2.17 细胞周期分析

2.2.18 细胞集落形成检测

3.结果

3.1 HP基因及其表达蛋白性质的初探

3.1.1 新基因Hp的克隆

3.1.2 HP的生物信息学分析

3.1.3 HP在哺乳动物细胞中的表达及定位

3.1.3.1 HP在哺乳动物细胞中的表达

3.1.3.2 内源性HP的转录

3.1.3.3 HPmRNA在乳腺肿瘤细胞中的表达

3.1.3.4 HP的细胞内定位

3.1.4 HP信号肽序列分析

3.1.4.1 HP（1-800aa）FLAG表达载体的构建

3.1.4.2 HP（1-800aa）重组质粒的酶切鉴定

3.1.4.3 重组质粒的表达鉴定

3.1.4.4 氨基酸序列分析

3.1.5 HP抗体

3.1.5.1 HP缺失突变体GST表达载体

3.1.5.2 HP缺失突变体His表达载体

3.1.5.3 HP缺失突变体GST/His重组质粒的诱导表达与蛋白纯化

3.1.5.4 HP抗体的检测

3.2 HP与Smad4存在相互作用

3.2.1 HP与Smad4在酵母细胞中存在相互作用

3.2.2 HP与Smad4在体内外的相互作用

3.2.2.1 HP与Smad4在体内的相互作用

3.2.2.2 HP与Smad4在体外的相互作用

3.3 HP的转录调节活性

3.3.1 HP及突变体能抑制3TP-lux报告基因转录活性

3.3.2 HP调节TGF-β应答的报告基因转录活性

3.3.3 HP-siRNA对HP转录调节活性的影响

3.3.3.1 HP-siRNA靶序列测序分析

3.3.3.2 HP-siRNA对外源HP基因表达的影响

3.3.3.3 HP-SiRNA表达抑制TGF-β应答的报告基因的转录

3.3.4 HP调节ER应答的报告基因的转录活性

3.4 HP的蛋白表达调节活性

3.4.1 HP在MCF-7细胞中过量表达

3.4.2 HP调节Smad4信号转导相关蛋白的表达

3.4.3 HP调节TGF-β靶基因的表达

3.4.4 HP调节信号下游蛋白的表达

3.4.5 HP调节细胞周期蛋白的表达

3.5 HP的细胞学功能

3.5.1 HP过量表达调节细胞的生长

3.5.1.1 HP的过量表达抑制MCF-7细胞的生长

3.5.1.2 HP-MCF-7细胞的条件培养基调节细胞的生长

3.5.1.3 Smad4与HP调节细胞生长的关系

3.5.2 HP过量表达细胞周期停滞在G2/M期

3.5.3 HP蛋白表达影响癌细胞克隆形成

3.6 TβRⅡ抑制剂对HP调节蛋白表达活性的影响

3.6.1 TβRⅡ抑制剂对细胞周期蛋白的表达的影响

3.6.2 TβRⅡ抑制剂对Smads蛋白及下游基因的表达的影响

4.讨论

5.结论及展望

5.1 主要结论

5.2 后续研究展望

参考文献

致谢

附录

1.克隆

2.引物

3.缓冲液

4.缩写词

攻读硕士学位期间发表或待发表的文章

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