论文题目: 丙型肝炎病毒基因组复制模板选择性的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 叶力
导师: 叶林柏
关键词: 丙型肝炎病毒,基因组复制,模板选择性,依赖于的聚合酶,蛋白,合成的顺式作用元件
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: DNA和RNA都是遗传物质,人们对于DNA的复制机制已经有了比较透彻的了解,但对RNA的复制还不清楚。RNA的复制为病毒所特有,利用正链RNA病毒开展有关RNA复制的研究在分子生物学和遗传学基本理论方面具有重要意义,同时也可以加强对RNA病毒的认识,并为抗病毒治疗提供新的策略。 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种具囊膜的正链RNA病毒,基因组长约9.6kb,由5’编码区、3’编码区和一个大的开放阅读框架(ORF)组成。ORF编码一个约3000氨基酸残基组成的多聚蛋白前体,经宿主蛋白酶和HCV编码的蛋白酶切割后产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白,其中非结构蛋白NS5B具有依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)活性,是HCV基因组复制的关键酶。HCV的基因组复制和其它正链RNA病毒类似,先以正链RNA为模板合成出互补的负链RNA,然后再以新合成的负链RNA为模板合成子代正链RNA,因此一致认为HCV正链RNA和负链RNA的3’端序列在起始病毒基因组复制的RNA合成中起重要作用。HCV在基因组复制时出现不对称复制:产生的正链RNA数量比负链RNA多得多,前者是后者的10—100倍,这一现象表明HCV基因组复制时对HCV正、负链RNA模板的选择性是非常强的。目前尚不清楚模板选择性的机制。本论文利用纯化的HCV NS5B蛋白以及HCV正链、负链3’末端RNA,在体外条件下研究NS5B利用两种模板进行RNA合成的情况,以探讨HCV基因组模板选择性的机制。 将HCV NS5B基因克隆至原核表达载体pET-His,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。为提高蛋白的可溶性表达,将NS5B C末端疏水性的21个氨基酸缺失,在一定的培养条件下,经过IPTG诱导获得可溶性蛋白。进一步通过组氨酸亲合层析获得纯化的蛋白,经Western blot检测确定是HCV NS5B蛋白。 把对应于HCV正、负链RNA3’末端序列的DNA序列克隆至体外转录质粒pGEM3Zf(+),通过体外转录制备HCV正链、负链3’末端RNA,分别作为RNA模板进行RdRp反应,用Northern blot和RT-PCR检测产物合成情况,结果没有检测到以正链RNA为模板的负链RNA产物,而以负链RNA为模板,可以合成一条全长的正链RNA产物;进一步将两种模板混合,进行模板竞争性实验,正链RNA模
论文目录:
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英文摘要
第一章 丙型肝炎病毒分子生物学
1.1 HCV的基因组
1.2 HCV分型
1.3 病毒复制
1.3.1 吸附和进入
1.3.2 蛋白前体的翻译和加工
1.3.3 RNA复制
1.3.4 病毒粒子的组装和释放
1.4 病毒—细胞相互作用
1.4.1 Core蛋白
1.4.2 E2蛋白
1.4.3 NS3蛋白
1.4.4 NS5A蛋白
1.4.5 NS4A和NS4B蛋白
1.5 研究HCV复制的模型系统
1.5.1 动物模型发
1.5.2 HCV复制子(replicon)系统
第二章 正链RNA病毒基因组的复制
2.1 正链RNA病毒基因组的复制
2.1.1 正链RNA病毒基因组RNA结构特点和多样性
2.1.2 正链RNA病毒基因组的复制策略
2.1.3 正链RNA病毒的RdRp
2.1.4 正链RNA病毒基因组复制时RNA合成的起始
2.1.5 正链RNA病毒基因组复制的模板特异性
2.2 HCV基因组复制
2.2.1 HCV RdRp(HCV NS5B)
2.2.2 HCV RNA作为复制模板的特性
2.2.3 HCV其它非结构蛋白在HCV基因组复制中的作用
2.2.4 细胞分子在HCV基因组复制中的作用
2.3 本研究的目的
第三章 HCV NS5B基因的克隆、表达和纯化
3.1 材料和方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 重组表达质粒pET-5B的构建
3.1.3 重组质粒pET-5B在BL21(DE3)中的诱导表达
3.1.4 NS5B蛋白的纯化
3.2 实验结果
3.2.1 HCV NS5B基因的扩增以及重组质粒pET-5B的鉴定
3.2.2 HCV NS5B基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达、纯化及鉴定
3.3 讨论
第四章 体外转录制备RNA模板
4.1 材料和方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 重组质粒pGEM-(+)3’T和pGEM-(-)3’T的构建
4.1.3 体外转录制备HCV(+)3’T和(-)3’T RNA
4.2 实验结果
4.2.1 重组质粒pGEM-(+)3’T的鉴定
4.2.2 重组质粒pGEM-(-)3’T的鉴定
4.2.3 体外转录制备RNA及其纯化
4.3 讨论
第五章 以HCV正、负链3’末端序列为模板的RdRp反应及模板竞争性实验
5.1 材料和方法
5.1.1 实验材料
5.1.2.体外RdRp反应
5.1.3 RNA探针的制备
5.1.4 斑点杂交检测RdRp反应产物及检验RNA探针的特异性
5.1.5 Northern blot检测RdRp反应产物
5.1.6 RT-PCR检测RdRp反应产物
5.2 结果
5.2.1 斑点杂交检测(+)3’T RNA和(-)3'T RNA为模板的RdRp反应产物
5.2.2 RNA探针的特异性
5.2.3 Northern blot检测(+)3’T RNA和(-)3’T RNA为模板的RdRp反应产物
5.2.4 模板竞争性RdRp反应
5.2.5 RT-PCR检测(+)3’T RNA和(-)3’T RNA为模板的RdRp反应产物
5.3 讨论
第六章 HCV负链RNA3’末端序列和结构对合成正链RNA的影响
6.1 材料和方法
6.1.1 实验材料
6.1.2 体外转录制备各种突变的(-)3’T RNA模板
6.1.3 体外RdRp反应
6.1.4 Northern blot检测RdRp反应产物
6.2 实验结果
6.2.1 体外转录制备的各种突变(-)3’T RNA模板
6.2.2 (-)3’T RNA 3’端第一个茎环结构对RNA合成的影响
6.2.3 (-)3’T RNA的3’C对RNA合成的影响
6.3 讨论
附录：实验试剂配制
参考文献
在读期间发表的论文
后记
发布时间: 2006-03-27
参考文献
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