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猪和大鼠小肠黏膜热应激损伤修复机制的研究

2020-12-08阅读(130)

猪和大鼠小肠黏膜热应激损伤修复机制的研究

论文摘要

小肠不仅是动物机体获得各种营养物质的主要场所,同时在屏障、免疫、代谢和内分泌等方面也发挥重要作用。在正常情况下,动物机体循环血流量的30%流经胃肠道,然而当环境温度大幅度升高,动物发生热应激反应时,机体启动散热和自我保护机制,全身血液重新分配：一方面加大体表和外周的循环血流量促进散热,同时保持心脑等器官的血流供应量。这样的后果使流经肠道血量急剧减少,导致肠道缺血、缺氧。小肠黏膜特殊的微循环结构使其对缺血、缺氧非常敏感,血流量不足可导致肠黏膜上皮细胞坏死、脱落,固有层裸露。小肠黏膜上皮细胞的损伤不仅破坏小肠的消化吸收功能,导致动物的生产性能下降；同时还使肠黏膜通透性增大,屏障功能破坏,使得有害分子如细菌、病毒和内毒素等穿过肠道屏障进入机体内,诱发各种疾病,给畜禽养殖业带来巨大的经济损失。研究表明中药在抗应激,促进肠道损伤修复方面有较好的应用效果,但有关其作用机理的报道较少。本试验通过猪、大鼠和IEC-6细胞三个热应激模型,研究小肠黏膜热损伤修复机理,筛选出多个关键的调节因子,为开发促小肠黏膜损伤修复相关的中药提供理论基础。此外,还比较分析了三个模型之间关联性,为构建一个由本动物-模式动物-体外细胞组成的高通量中药筛选、中药组方、药效评价的高通量平台进行初步探索。本研究开展了以下试验：1、热应激对猪和大鼠小肠形态结构的影响。2、热应激对猪和大鼠小肠基因表达谱的影响,并完成差异基因的生物信息学分析,筛选出小肠黏膜损伤修复的相关因子。3、对基因芯片所筛选出的与小肠黏膜损伤修复密切相关的长因子和ERK1/2信号通路进一步深入研究,包括：（一）热应激对大鼠小肠生长因子表达和ERK1/2信号通路蛋白磷酸化水平的影响。（二）热应激对IEC-6细胞形态结构、细胞活力、细胞凋亡、生长因子表达和ERK1/2信号蛋白磷酸化水平的影响。（三）抑制ERK1/2信号通路后热应激对IEC-6细胞的损伤、凋亡和生长因子表达的影响。4、本动物（猪）-模式动物（大鼠）-体外细胞（IEC-6）热应激模型的相关性分析。研究结果：1、热应激降低猪的生长速度,导致猪小肠黏膜损伤,以十二指肠和空肠损伤最为严重。损伤的小肠黏膜上皮细胞脱落,固有层裸露。透射电镜结果显示,热应激组猪的小肠微绒毛变短,线粒体肿胀,次级溶酶体数量增多,细胞连接变宽。2、热应激猪小肠的基因表达谱发生改变,在猪已知的两万多个基因中有93基因表达显著上调,110个显著下调（T<0.01, Fold chang>2）.并对差异基因进行了分子功能、生物学进程、细胞组分的注释。完成Pathway way分析,并发现Linoleic acid metabolism（亚油酸代谢）、MAPK signaling pathway（丝裂原通路）、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450（细胞色素P450代谢途径）、Arachidonic acid metabolism（精氨酸代谢途径）在热应激过程发挥重要作用。3、热应激导致大鼠小肠黏膜严重损伤,并改变其基因表达谱。41000个基因中有270个上调,122个下调（T<0.01, Fold chang>2）。结合猪基因芯片结果,筛选确定出10个生长子和ERK1/2信号通路是小肠黏膜热损伤修复的关键调节因子,并用荧光定量PCR对基因芯片结果加以验证。其中Fgfr3, Tgif, Pdgfa, Vegfa, Gdfl5, Okl38和Gdf9的表达显著上调；Alb, Egfr和Ctgf表达显著下调。Western-blot结果显示热应激后大鼠空肠ERK1/2蛋白的磷酸化水平显著升高。4、热应激导致大鼠IEC-6细胞明显形态损伤,细胞活力显著降低（MTT试验）,细胞凋亡率显著升高（annexin V/PI双染后流式细胞仪细胞计数）,ERK1/2通路蛋白磷酸化水平显著升高。5、在IEC-6细胞热应激时,加入ERK1/2信号通路的特异性抑制剂（U0126）后,IEC-6细胞出现更为严重的损伤,细胞凋亡率显著升高（超过80%的早期凋亡,10%的晚期凋亡）,生长因子的基因表达也发生改变。6、对三个热应激模型进行相关性分析发现：（1）猪和大鼠热应激模型在临床症状、小肠黏膜损伤和基因表达谱等诸多方面的变化相似；（2）体内和体外热应激模型在生长因子的基因表达和ERK1/2通路蛋白的磷酸化等方面的变化也一致。研究结论：1、热应激导致猪和大鼠小肠黏膜出损伤,并改变其基因表达谱。2、生长因子和ERK1/2信号通路通在小肠热损伤修复中发挥重要作用。3、本动物（大鼠）-模式动物（大鼠）-体外细胞（IEC-6）热应激模型相关性较高。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 图表目录
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 应激
  • 1.1.1 应激概念
  • 1.1.2 应激发生的过程
  • 1.1.3 应激的机理
  • 1.1.4 应激反应的结果
  • 1.2 热应激
  • 1.2.1 猪的热应激
  • 1.2.1 热应激与动物小肠
  • 1.3 小肠黏膜结构和损伤修复
  • 1.3.1 小肠黏膜结构
  • 1.3.2 小肠黏膜损伤和修复
  • 1.3.3 小肠黏膜损伤修复的相关因子
  • 1.4 生长因子
  • 1.4.1 生长因子的定义
  • 1.4.2 生长因子的特点和功能
  • 1.4.3 生长因子的分类
  • 1.5 ERK1/2信号通路
  • 1.5.1 ERK信号通路的组成及转导
  • 1.5.2 ERK信号通路图
  • 1.5.3 ERK信号通路的研究进展
  • 1.5.4 ERK信号通路与生长因子及损伤修复的联系
  • 1.6 IEC细胞的体外培养
  • 1.7 基因芯片技术的应用
  • 1.8 研究内容的技术路线
  • 1.8.1 总的试验框架
  • 1.8.2 猪的热应激试验技术路线
  • 1.8.3 大鼠和IEC-6细胞试验技术路线
  • 第二章 热应激对小肠黏膜结构的影响
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 试验动物
  • 2.2.2 主要仪器设备
  • 2.2.3 主要试剂
  • 2.2.4 试验动物分组及处理
  • 2.2.5 样品采集、处理与保存
  • 2.2.6 测试方法
  • 2.2.7 统计分析
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 猪临床症状、体温和血清皮质醇变化
  • 2.3.2 猪体重增长速度
  • 2.3.4 猪小肠形态结构
  • 2.3.5 猪小肠黏膜上皮细胞的超微结构
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 热应激模型的评价
  • 2.4.2 热应激导致猪小肠黏膜损伤
  • 2.5 小结
  • 第三章 热应激对猪空肠基因表达谱的影响及表达差异基因的生物信息学分析
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 主要仪器设备
  • 3.2.2 主要试验试剂
  • 3.2.3 试验方法
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 杂交前RNA定量和质检结果
  • 3.3.2 芯片杂交结果整体评价
  • 3.3.3 芯片数据分析结果
  • 3.3.4 荧光定量PCR验证芯片结果
  • 3.3.5 差异基因的GO分类
  • 3.3.5 差异基因的Pathway分析
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 热应激影响猪小肠的基因表达谱
  • 3.4.2 猪小肠黏膜热损伤修复相关的信号通路
  • 3.5 小结
  • 第四章 热应激对大鼠小肠黏膜结构及损伤修复相关基因表达的影响
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 试验动物
  • 4.2.2 主要仪器设备
  • 4.2.3 主要试剂
  • 4.2.4 试验方法
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 体表温度、直肠温度和血清皮质醇浓度
  • 4.3.2 小肠形态结构变化
  • 4.3.3 筛选损伤修复相关的差异基因
  • 4.3.4 生长因子相关的差异基因聚类分析
  • 4.4 讨论
  • 4.5 小结
  • 第五章 生长因子和ERK1/2信号通路在大鼠小肠热应激损伤修复中的作用
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料和方法
  • 5.2.1 试验动物
  • 5.2.2 试验细胞
  • 5.2.3 主要的仪器设备
  • 5.2.4 主要试剂
  • 5.2.5 溶液与配制
  • 5.2.5 试验方法
  • 5.3 结果与分析
  • 5.3.1 热应激对IEC-6细胞形态结构及增殖活力的影响
  • 5.3.2 热应激诱导IEC-6细胞凋亡
  • 5.3.3 热应激对大鼠空肠生长因子基因表达的影响
  • 5.3.4 热应激和ERK1/2信号通路对大鼠IEC-6细胞生长因子表达的影响
  • 5.3.5 大鼠空肠和IEC-6细胞ERK1/2的磷酸化水平
  • 5.4 讨论
  • 5.4.1 热应激导致大鼠IEC-6细胞形态损伤,降低细胞增殖活力
  • 5.4.2 热应激诱导大鼠IEC-6细胞凋亡,影响生长因子的基因表达
  • 5.4.5 ERK1/2通路在小肠黏膜热损伤修复中的作用
  • 5.5 小结
  • 第六章 结论、创新点与建议
  • 6.1 主要结论
  • 6.2 创新点
  • 6.3 有待进一步研究的问题
  • References
  • 致谢
  • 作者简介
  • 硕士期间参与发表的SCI文章
  • 待发表的SCI文章

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