乙型肝炎病毒DNA聚合酶功能域结合蛋白和反式调节基因的研究

论文题目: 乙型肝炎病毒DNA聚合酶功能域结合蛋白和反式调节基因的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 传染病

作者: 陈国凤

导师: 张玲霞,成军,李莉

关键词: 乙型肝炎病毒,酵母,基因芯片

文献来源: 中国人民解放军军医进修学院

发表年度: 2005

论文摘要: 乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒,HBV DNA长度约为3.2kb,含4个开放读码框架(ORF),分别编码HBV的表面抗原蛋白,核心/e抗原蛋白,X蛋白以及HBV DNA聚合酶(HBV Pol)。HBV Pol基因在ORF中最长,并且与C、S、X基因区有重叠,其编码的P蛋白含有3个功能域和1个无意义的隔离片(spacer,SP),排列顺序为N-末端蛋白(TP),SP,逆转录酶(RT)/DNA聚合酶(PR)和核糖核酸酶H(RNase H)。由于受到不能从病毒体直接纯化和在不同的系统中表达有活性的酶的限制,目前对聚合酶及其所编码的各个功能区域蛋白质的功能的认识还不是很清楚。为了研究病毒蛋白质对肝细胞的作用,用酵母双杂交技术筛选HBV Pol蛋白与肝细胞相互作用蛋白的编码基因;用基因表达谱芯片技术,筛选各功能域的反式调节基因。 根据含有HBV Pol全基因组cDNA的质粒G318A7 AF384372,设计了TP、PR和RNase H引物,PCR扩增后构建酵母表达载体pGBKT7-TP、pGBKT7-PR、pGBKT7-RNase H,用醋酸锂法转入酵母细胞AH109后,表达各自蛋白,用Western blotting确定蛋白表达。将转化好的AH109/pGBKT7-TP酵母菌与含有肝cDNA文库的酵母菌Y187在营养缺陷培养基(三缺培养基:SD/-His/-Leu/-Trp,四缺培养基:SD/-Trp-Leu-His-Ade)上进行配合,在铺有X-α-gal的四缺培养基上进一步筛选。挑取蓝色阳性菌落提取酵母质粒。测序并进行生物信息学分析。 对TP的研究中,成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆,包括人类固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、Ⅰ型乙醇脱氢酶γ亚基(ADH3),也称为依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶,RNA聚合酶Ⅱ亚单位(hsRPB7)、血浆铜蓝蛋白(CP),去唾液酸糖蛋白受体2(ASGR2)等21种已知功能蛋白质基因和19个假设蛋白基因。提示TP可以与人肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,具有较广泛的生物学功能。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

正文

第一部分 基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA聚合酶三个功能域反式调节基因

引言

第一章 HBV DNA聚合酶TP反式调节基因的筛选研究

第二章 HBV DNA聚合酶PR反式调节基因的筛选研究

第三章 HBV DNA聚合酶RNase H反式调节基因的筛选研究

讨论

第二部分 HBV DNA聚合酶功能域蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达

引言

第一章 HBV DNA聚合酶TP蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达

第二章 HBV DNA聚合酶PR蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达

第三章 HBV DNA聚合酶酶RNase H蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与表达

讨论

第三部分 酵母双杂交筛选与TP蛋白相互作用蛋白

引言

第一节 酵母配合筛选

第二节 从阳性酵母中提取质粒

第三节 复杂方法冰冻高效价感受态方案

讨论

总结及展望

攻读博士学位期间发表的文章

文献综述一

文献综述二

附录一 主要仪器设备

附录二 英文缩略词

致谢

发布时间: 2005-07-15

参考文献

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