论文摘要
应激调节肽CRF （corticotrophin-releasing factor, CRF）基因家族在动物环境适应与进化过程中起着重要作用,应激时,下丘脑分泌的CRF经垂体门脉进入垂体前叶与垂体促肾上腺皮质激素细胞膜上的CRFR1α（corticotrophin-releasing factor type 1αreceptor, CRFR1α）受体结合促使ACTH （adrenocorticotropic hormone, ACTH）释放,进而促进肾上腺皮质分泌皮质酮,调节机体一系列生理功能。生活在青藏高原的高原鼠兔（Ochotona curzoniae, Hodgson）、高原鼢鼠（Myospalax baileyi, Thomas）和根田鼠（Microtus oeconomus, Pallas）对高原低氧环境具有一套特殊的适应机制。我们实验室前期研究发现高原鼠兔、高原鼢鼠和根田鼠的HPA（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）轴对低氧应激呈低反应性,为了阐述是否这与它们的CRFR1α受体结构相关,我们以CRFR1α及其配体CRF和Ucn（Urocortin,Ucn）为研究对象,克隆了这三种高原动物CRFR1α、CRF和Ucn基因,研究了这些CRFR1α受体与CRF的亲和力、CRF和r/mUcn分别刺激这三种新受体产生‘的第二信使cAMP的变化以及调节水通道蛋白AQP4导致CHO细胞水肿的差异,并与平原动物大鼠、小鼠和大白兔进行了比较。主要研究结果如下：1.克隆了高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠和大白兔CRFR1α基因cDNA序列,编码区核苷酸序列全长均为1248bp,编码415aa的前体蛋白序列。克隆了高原鼠兔、高原鼢鼠和大白兔CRF成熟肽序列,核苷酸序列全长均为123bp,编码41aa的成熟肽。克隆了高原鼢鼠和根田鼠Ucn的cDNA序列,高原鼢鼠核苷酸序列长369bp,前体肽为122aa,根田鼠核苷酸序列长372bp,前体肽为123aa。它们的成熟肽均为40aa的蛋白序列。通过序列比对发现,CRF成熟肽序列高度保守,三种高原动物与GenBank上已知序列的大鼠、小鼠、大白兔、人、猫、狗和猪的完全相同。高原鼢鼠的Ucn成熟肽与GenBank上已知序列的大鼠、小鼠、牛和羊的完全一致,根田鼠有3个氨基酸不同。而三种高原动物CRFR1α存在多个变异位点并各具特点。与大鼠、小鼠、大白兔和人的相比高原鼠兔有8个独有的变异位点,高原鼢鼠有6个,根田鼠有5个独有的变异位点。这些变异位点在胞外区、跨膜区和胞内区均有分布。2.分别构建了高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠、大鼠、小鼠和大白兔的CRFR1α的真核表达载体,分别命名为oc-CRFR1、mb-CRFR1、mo-CRFR1、r-CRFR1、m-CRFR1和nr-CRFR1。分别将这六种CRFR1α真核表达载体瞬时转染CHO细胞,获得表达这六种CRFR1α的CHO细胞,分别命名为oc-CRFR1-CHO、mb-CRFR1-CHO、mo-CRFRl-CHO、r-CRFR1-CHO、m-CRFR1-CHO和nr-CRFR1-CHO。3.分别提取了oc-CRFR1-CHO、mb-CRFR1-CHO、mo-CRFR1-CHO和m-CRFR1-CHO的粗膜片段,用放射性同位素125-Ⅰ标记的CRF（Phonexipeptide,USA）进行了配体／受体亲和力的研究,结果表明CHO细胞中表达的三种高原动物CRFR1α膜蛋白与CRF配体结合的最大结合位点（Bmax）基本一致,高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠和小鼠分别为1222fmol/mg pr、1224fmol/mg pr、1231fmol/mg pr和1225fmol/mg pr。发现高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠和小鼠的CRFR1α受体平衡解离常数Kd值明显不同,分别为1617pM、1478pM、1509pM和1191pM。三种高原动物的Kd值均明显高于平原动物小鼠,其中以高原鼠兔最大、根田鼠次之、高原鼢鼠最小。说明高原动物CRFR1α受体的亲和力比平原动物小鼠的亲和力小。4.在分别表达这六种CRFR1α的CHO细胞体系中用ELISA试剂盒（Cayman,USA）检测了CRF和r/mUcn分别刺激含这六种受体的CHO细胞产生的cAMP水平。发现CRF和r/mUcn配体刺激CHO细胞15分钟后,产生的cAMP水平呈剂量依赖相关性,但半数有效剂量（EC50）不同。CRF配体处理组,高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠、小鼠、大白兔和大鼠的EC50值分别为8.354nM、6.431nM、6.250nM、4.226nM、3.701nM和3.530nM。最高的高原鼠兔的EC50值比最低的大鼠EC50值高2.4倍。r/mUcn配体处理组中,高原鼢鼠、根田鼠、高原鼠兔、大白兔、大鼠和小鼠的EC50值分别为20.36nM、13.00nM、4.310nM、3.046nM、2.239nM和1.601nM。最高的高原鼠兔的EC50值比最低的小鼠EC50值高12.7倍,根田鼠与小鼠差8倍,高原鼠兔与小鼠差2.6倍。在CRF或r/mUcn配体处理后,三种高原动物CRFR1α受体的EC50值均比三种平原对照动物的EC50值高。CRF配体产生cAMP的EC50值依高低顺序为高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠。Ucn配体刺激产生的高低顺序为高原鼢鼠、根田鼠、高原鼠兔。提示这些差异是CRFR1α受体结构特性决定的。5.构建了共表达高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠和大鼠CRFR1α与大鼠水通道rAQP4的CHO细胞系,分别命名为oc-CRFR1/rAQP4-CHO mb-CRFR1/rAQP4-CHO、mo-CRFR1/rAQP4-CHO和r-CRFR1/rAQP4-CHO。用CRF和r/mUcn分别孵育上述转染细胞,发现三种CRFR1α受体介导rAQP4蛋白参与细胞水通透性调节引起的CHO细胞水肿不同。CRF刺激oc-CRFR1/rAQP4-CHO、mb-CRFR1/rAQP4-CHO、mo-CRFR1/rAQP4-CHO和r-CRFR1/rAQP4-CHO细胞水肿程度没有显著差异。r/mUcn孵育后oc-CRFR1/rAQP4-CHO、mb-CRFR1/rAQP4-CHO、mo-CRFR1/rAQP4-CHO细胞的水肿程度比大鼠r-CRFR1/rAQP4-CHO的轻,其中高原鼢鼠mb-CRFR1/rAQP4-CHO细胞水肿程度最轻,高原鼠兔、根田鼠与平原动物大鼠r-CRFR1/rAQP4-CHO的水肿没有明显差异,也提示这些差异与受体结构差异相关。三种高原动物CRFR1α受体及根田鼠的Ucn配体序列存在不同程度的氨基酸突变,这些CRFR1α受体序列的不同导致它们与CRF配体结合的亲和力不同,诱导第二信使cAMP水平不同,以及通过下游靶效应器AQP4导致CHO细胞水肿程度也不同,这可能是CRFR1α受体结构差异性决定的,是三种高原动物HPA轴低反应性的部分机制。
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