cPL双抗体夹心ELISA检测犬急性胰腺炎方法的建立与应用

论文摘要

犬急性胰腺炎是临床上对犬危害较大的一种内科疾病,急性胰腺炎发病急、病程短、临床症状严重、难以治愈,甚至导致死亡。有很多急性病例由于未得到确切的诊断,耽误治疗而发展为慢性或亚慢性胰腺炎。病情反复发作,给患犬带来极大的痛苦,也给犬主带来了很多麻烦。因此,研制一种快速、准确诊断犬急性胰腺炎的方法具有重要的意义。本试验依据cPL检测犬胰腺炎的特异性、敏感性和准确性的特点,按照cPL的DNA序列重组cPL,并研制抗新西兰白兔的抗犬胰脂肪酶抗体（cPL-AB-N）和抗美国白兔的抗犬胰脂肪酶抗体（cPL-AB-A）,利用cPL的免疫活性原理,成功地制备了检测cPL双抗体夹心ELISA检测板。并用倍比稀释的含有cPL标准溶液对所建立的ELISA检测板进行验证,结果表明,所建立的ELISA检测板检测所得的曲线与标准曲线基本吻合。然后,我们用cPL双抗体夹心ELISA检测板对40只健康犬的血清的cPL的浓度进行检测,其中除了样本T30的检测结果为365.6μg L-1外,其他的值均在文献报道的参考范围之内,故本试验选择与文献报道的参考范围一致,即健康犬血清中犬cPL的浓度的参考范围为2.2-119.2μg L-1。为cPL双抗体夹心ELISA检测板的临床应用提供了必要的参考依据。最后,我们使用所制得的cPL双抗体夹心ELISA检测板,并对照本试验所制定的参考范围,对40份来自于临床疑似犬急性胰腺炎的犬血清样本进行检测,只有一个样本（T38）的cPL含量在我们所建立的标准范围2.2-119.2μgL-1之内,其他39个样本的cPL含量均远远高于正常标准范围的上限,有24个血清样本的cPL含量已经超过了150.0μg L-1。有4个血清样本的cPL浓度为都已经超过了200μg L-1,有的甚至超过正常范围（2.2-119.2μg L-1）最高限的一倍还多。可依据犬血清中cPL含量的检测结果,然后结合患犬所表现出来的临床症状诊断是否患有胰腺炎。此试验为临床确诊犬急性胰腺炎提供了快速、准确的方法。本试验结果表明,使用ELISA检测板对cPL的浓度进行检测从而进行诊断犬急性胰腺炎是一种准确、方便、快捷的检测方式,值得在兽医临床上推广。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 前言
• 第一部份 文献综述
• 第一章 犬急性胰腺炎病因及病理发生
• 1 犬胰腺解剖结构
• 2 犬胰腺的生理功能
• 2.1 分泌消化酶
• 2.2 防止自体消化
• 2.3 胰腺分泌的调节
• 3 胰腺炎
• 3.1 犬急性胰腺炎的病因
• 3.1.1 营养,高脂蛋白血症,遗传因素
• 3.1.2 药物,毒素,高钙血症
• 3.1.3 导管堵塞
• 3.1.4 十二指肠反流,胰腺创伤和胰腺局部缺血
• 3.1.5 其他
• 3.2 犬急性胰腺炎的发病机制
• 3.2.1 "共同通道"学说与胰酶的异常激活
• 3.2.2 细胞因子的"瀑布效应"和全身炎症反应
• 3.2.3 胰腺微循环障碍
• 3.2.4 胰腺细胞凋亡
• 3.2.5 肠道细菌移位
• 3.3 急性胰腺炎时的病理改变
• 3.3.1 局部变化
• 3.3.2 全身变化
• 第二章 犬胰腺炎诊断概述
• 1 病史和临床症状
• 2 影像学检查
• 3 胰腺活检
• 4 实验室诊断
• 4.1 血液学检查
• 4.2 血液生化指标测定
• 4.2.1 淀粉酶（AMYLASE,AMY）
• 4.2.2 脂肪酶（LIPASE,LP）
• 4.2.3 犬胰脂肪酶免疫反应性（CANINE PANCREATIC LIPASE IMMUNOREACTIVITY,CPLI）
• 4.2.5 胰石蛋白（PANCREATIC STONE PROTEIN,PSP）
• 4.2.6 白细胞介素（INTERLEUKIN,IL）
• 4.2.7 肿瘤坏死因子（TUMOR NECROSIS FACTOR,TNF-A）
• 4.2.8 急性时相性蛋白（ACUTE PHASE PROTEIN,APP）
• 4.2.9 多形核粒细胞弹性蛋白酶（POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTE ELASTASE,PMN-E）
• 4.2.10 胰蛋白酶原激活肽（TRYPSINOGEN ACTIVATION PEPTIDE,TAP）
• 4.2.11 磷脂酶A2（PHOSPHOLIPASE A2,PLA2）
• 参考文献
• 第二部分 试验研究
• 第三章 CPL双抗体夹心ELISA检测板的建立与检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 试验样品
• 1.1.3 重组犬胰脂肪酶（RECOMBINANT CPL,RE-CPL）
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 纯化犬胰脂肪酶（CANINE PANCREATIC LIPASE,CPL）
• 1.2.2 制备犬胰脂肪酶（CPL）标准浓度溶液
• 1.2.3 空白对照液
• 1.2.4 制作和纯化抗新西兰白兔的抗犬胰脂肪酶抗体（CPL-AB-N）
• 1.2.5 制作和生物素化抗美国白兔的抗犬胰脂肪酶抗体（CPL-AB-A）
• 1.2.6 建立测量犬胰脂肪酶免疫活性的ELISA方法
• 2 结果与分析
• 2.1 CPL的标准溶液
• 2.2 CPL-AB-N和CPL-AB-A
• 2.3 建立CPL双抗体夹心ELISA检测板
• 2.4 CPL双抗体夹心ELISA检测板的检测
• 3 讨论
• 3.1 纯化CPL制备犬胰脂肪酶标准浓度溶液
• 3.2 制作和纯化CPL-AB-N及生物素化CPL-AB-A
• 3.3 制作和验证ELISA检测板
• 3.3.1 制作双抗体夹心ELISA检测板
• 3.3.2 测定双抗体夹心ELISA检测板的反应条件
• 3.3.3 使用CPL的标准溶液检测双抗体夹心ELISA检测板
• 3.4 用ELISA检测犬血清中的CPL的优点
• 3.4.1 CPL的敏感度、特异度和准确度高
• 3.4.2 ELISA检测板检测CPL的特异性高
• 第四章 健康犬CPL双抗体夹心ELISA检测板的检测研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 阳性对照组和空白对照组
• 1.1.5 生物素化的抗犬胰脂肪酶抗体（CPL-AB-A）
• 1.2 方法
• 1.2.1 制备犬血清
• 1.2.2 使用双抗体夹心ELISA检测板进行检测
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 3.1 制备CPL溶液
• 3.2 建立犬胰脂肪酶抗体（CPL）的参考范围
• 3.3 CPL对诊断犬急性胰腺炎的诊断意义
• 3.3.1 双抗体夹心ELISA检测板的特异性
• 3.3.2 双抗体夹心ELISA检测板的方法简单易行
• 第五章 CPL双抗体夹心ELISA检测板的诊断研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验样本
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 阳性对照组和空白对照组
• 1.1.5 生物素化的抗犬胰脂肪酶抗体（CPL-AB-A）的抗抗体
• 1.2 方法
• 1.2.1 制备犬血清
• 1.2.2 使用双抗体夹心ELISA检测板进行检测
• 2 结果与分析
• 2.1 检测样本、阳性对照组及空白对照组的检测结果
• 3 讨论
• 3.1 制备犬血清和CPL溶液
• 3.2 使用血清中CPL的浓度诊断急性胰腺炎
• 3.3 CPL双抗体夹心ELISA检测板的优点
• 3.3.1 CPL的敏感度、特异度和准确度高
• 3.3.2 ELISA检测板检测CPL的特异性高
• 参考文献
• 全文总结
• 创新之处
• 致谢
• 在读硕士期间发表文章和参加学术活动