VEGF基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞生物学功能的影响

论文摘要

外伤、先天畸形、口腔颌面部肿瘤术后等原因常造成颌骨组织的缺损,严重影响患者的颜面部美观、导致咀嚼功能下降,给患者造成心理负担,从而影响患者的生活质量,给患者带来身心痛苦。在临床上,骨缺损的治疗一直是临床医师常见的、难以解决的、棘手的问题。目前主要采用自体骨、异体骨、人工合成替代物来进行修复,尽管这些方法可在一定程度上恢复颌骨的功能和外形,但都存在一定的局限性,如:来源有限、供体部位继发损伤、引起免疫排斥反应、塑形性差等,不能完全满足临床上治疗的需要。随着分子生物学、细胞生物学、组织工程和基因工程理论与实验技术的发展,组织工程骨成为颌骨修复重建的新方法,组织工程骨包含了3个要素:①间充质干细胞和骨祖细胞的分离和扩增;②合适的成骨生长因子;③模拟促进成骨的内环境的支架。但外源性的成骨生长因子存在着有半衰期、需要反复给药、易流失、效率低、价格昂贵等缺点。基因强化组织工程骨就是将外源性的编码成骨生长因子的基因转染靶细胞（种子细胞）,使成骨生长因子在细胞内稳定、持续、高效地表达并分泌到局部发挥作用,从而促进颌骨的修复和重建,成为解决该问题的新思路。组织工程骨的血管化也是影响较大体积组织工程骨是否成功的关键问题,VEGF是一个强有力的促进血管生成的细胞因子,具有内皮细胞特异性有丝分裂原活性,在体内能够刺激血管的发生,增加血管的渗透性。在骨组织的发育、骨折愈合和骨缺损的修复中通过促进血管的生成而间接发挥作用。所以VEGF可以成为组织工程血管化的候选生长因子。VEGF除了促进血管的生成而间接发挥作用外,对参与骨修复的细胞如骨髓间充质干细胞是否发挥作用以及其机制尚不清楚。骨髓间充质干细胞是骨髓内含有的非造血干细胞,具有多向分化潜能,在特定的条件下能够向成骨、成软骨、成肌细胞等方向分化,容易获取,来源丰富,并且外源基因易于导入细胞和表达的优点,是有前景的用于骨组织工程的种子细胞。腺病毒载体是具有良好前景的一种高效基因转移载体,腺病毒本身分子稳定,不与宿主基因组整合,没有基因毒性,不会引起插入突变,对靶细胞的病理损伤较小,分裂期和静止期细胞都可以感染,感染效率高,已经在临床和临床前研究中广泛的应用。腺病毒载体的基因表达仅维持几周或几个月,随着靶细胞的死亡而消失。这点对于骨的修复和重建是有利的,因为只希望发挥促进成骨作用的蛋白在骨愈合的特定时间里表达和保持较高的浓度。基于以上背景,本研究拟以腺病毒为载体,用VEGF基因转染体外培养扩增的大鼠骨髓间充质干细胞,研究VEGF对大鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响,并阐述其机制。首先,采用全骨髓贴壁法从大鼠骨髓中提取、分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,细胞培养基为含体积分数10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg /mL链霉素的L-DMEM培养基,在培养48小时首次换液,细胞贴壁生长,为多角形、梭形,并有3-5个细胞突起,随着培养时间延长,细胞逐渐增多,呈漩涡状、辐射状排列,并形成集落。培养至80-90%汇合时0.25%胰酶+0.02%EDTA传代。第三代细胞在成骨诱导培养基(含抗坏血酸50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、地塞米松10-8mol/L)内培养21天,茜素红染色,有矿化结节形成。在成脂诱导培养基（含IBMX0.5mmol/L、地塞米松10μmol/L、胰岛素10μmol/L、消炎痛200μmol/L）内培养14天,油红O染色有脂滴形成。结果表明体外成功培养和扩增了大鼠BMSCs,在特定条件下能够向成骨细胞分化,为以后的实验提供了细胞基础。第二,将携增强型绿色荧光蛋白的腺病毒载体（AdCMV-EGFP）以不同的MOI（0、100、200、400、600、800、1000particle/cell）转染第3代大鼠BMSCs。结果为AdCMV-EGFP在0、100、200、400时转染效率随MOI的增加而逐渐增加,并且细胞的形态没有变化,在MOI大于400时转染效率不再增加,细胞出现变圆、脱落。在荧光倒置显微镜下观察细胞在转染后的24小时就有EGFP的表达,5-7天时达到高峰,以后逐渐减弱,在转染后28天时仍有较弱的荧光。经AdCMV-EGFP转染后的细胞在成骨诱导培养液内培养21天后,茜素红染色,矿化结节形成的数量和大小与未转染组没有明显区别。结果表明AdCMV-EGFP能够有效的转染大鼠BMSCs,并且在一定的MOI范围内对细胞的形态和增殖没有影响,而且也不影响BMSCs的成骨分化能力。第三,按照上述确定的合适MOI（400particle/cell）携VEGF的腺病毒载体（AdCMV-VEGF）转染大鼠BMSCs,采用RT-PCR方法检测细胞内有VEGFmRNA的表达,转染后24小时采用ELISA方法在细胞培养上清中就检测到有VEGF的表达和分泌,在转染后第3天达到高峰,以后逐渐下降,并稳定表达一定时间。MTT比色法实验检测AdCMV-VEGF转染对大鼠BMSCs增殖的影响。结果表明AdCMV-VEGF能够成功转染大鼠BMSCs,并且VEGF在mRNA和蛋白水平均有表达,并能分泌到细胞外,分泌的VEGF能够促进大鼠BMSCs的增殖。第四,按照上述确定的合适MOI（400 particle/cell）AdCMV-VEGF转染大鼠骨BMSCs,并对细胞进行成骨诱导培养,在成骨诱导后6、9、12天进行碱性磷酸酶活性检测,在第6天时没有差异,在第9、12天转染组细胞的碱性磷酸酶活性高于未转染组（p<0.05）。在3、6、9、12天采用ELISA方法检测培养上清中OCN和COL?的含量,随着时间延长两组的OCN和COL?的含量均逐渐增高,OCN在第12天和COL?在第6、9、12天转染AdCMV-VEGF组的含量高于未转染组和转染AdCMV-EGFP组。在成骨诱导后3、7、14、21天采用实时定量PCR检测细胞COL?、OCN、RUNX2和OSX的表达,在第3天时4个基因的表达在转染AdCMV-VEGF组均高于未转染对照组,表明转染AdCMV-VEGF能够促进大鼠骨BMSCs成骨相关基因的表达。最后,骨组织发育和修复是一个多种生长因子参与的过程,因此本研究还用AdCMV-VEGF和AdCMV-BMP2共同转染大鼠BMSCs,从形态学角度观察细胞的变化,并检测VEGF和BMP2蛋白的表达情况。RT-PCR实验凝胶电泳显示有VEGF和BMP2的目的条带,细胞在转染后24小时采用ELISA方法可在培养上清液中检测到VEGF和BMP2的表达,在转染后第3天达到高峰。形态学观察共同转染组细胞聚集形成结节的数目和面积大于单独AdCMV-BMP2转染的细胞。结果表明AdCMV-VEGF和AdCMV-BMP2共同转染大鼠BMSCs,并且VEGF和BMP2基因在细胞内能够转录和表达,AdCMV-VEGF转染能够促进AdCMV-BMP2转染引起的BMSCs的成骨方向分化。本研究采用腺病毒载体介导VEGF转染BMSCs,研究了腺病毒载体转染BMSCs的可行性,以及VEGF转染对BMSCs功能的影响,为构建血管化组织工程骨提供实验基础,本研究的创新点在于将腺病毒为载体的VEGF转染用于组织工程骨的研究,以及体外研究VEGF对BMSCS成骨分化的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第1章 文献综述
• 1.1 VEGF 家族及其受体的研究进展
• 1.1.1 VEGF家族及其受体的结构
• 1.1.2 VEGF的功能和作用
• 1.2 骨再生基因治疗的研究进展
• 1.2.1 骨再生现有方法的局限性
• 1.2.2 骨组织工程的进展
• 第2章 大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和诱导分化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验主要仪器和试剂
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 大鼠BMSCs的培养
• 2.2.2 大鼠BMSCs成骨诱导培养
• 2.2.3 大鼠BMSCs成脂诱导培养
• 2.3 讨论
• 第3章 腺病毒介导EGFP 转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验主要仪器和试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 AdCMV-EGFP转染大鼠BMSCs
• 3.2.2 AdCMV-EGFP转染对大鼠BMSCs钙化结节形成能力的影响
• 3.3 讨论
• 第4章 VEGF 基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验主要仪器及试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 转染AdCMV-VEGF后细胞内VEGFmRNA的表达
• 4.2.2 转染后细胞内VEGF蛋白的表达
• 4.2.3 转染AdCMV-VEGF对大鼠BMSCs增殖的影响
• 4.3 讨论
• 第5章 VEGF 基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验主要仪器及试剂
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 转染后大鼠BMSCs的ALP活性检测
• 5.2.2 转染后大鼠BMSCs的OCN和COL?分泌蛋白检测
• 5.2.3 实时荧光定量PCR 检测转染VEGF 对大鼠BMSCs 成骨分化的影响
• 5.3 讨论
• 第6章 VEGF 与BMP2 双基因转染的体外研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验主要仪器及试剂
• 6.1.2 实验方法
• 6.2 实验结果
• 6.2.1 AdCMV-BMP2和AdCMV-VEGF转染大鼠BMSCs的VEGF和BMP2mRNA的表达
• 6.2.2 AdCMV-BMP2 和AdCMV-VEGF 转染大鼠BMSCs 的VEGF 和BMP2 蛋白的分泌
• 6.2.3 细胞转染后形态学观察
• 6.3 讨论
• 第7章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间取得的科研成果
• 致谢