木糖代谢关键酶基因克隆及重组酵母菌株构建

论文题目: 木糖代谢关键酶基因克隆及重组酵母菌株构建

论文类型: 博士论文

论文专业: 林产化学加工工程

作者: 徐勇

导师: 余世袁,黄敏仁

关键词: 重组酵母,木糖代谢,木糖还原酶基因,木糖醇脱氢酶基因,分类鉴定

文献来源: 南京林业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 生物乙醇作为一种清洁、便捷的可再生能源,被纳入许多国家的发展战略规划。廉价的原料和高效转化工艺是燃料乙醇商业化生产的必要条件,利用可再生植物纤维资源生物转化制取乙醇的研究成为当前的热点,其中木糖的高效乙醇发酵是该技术工业化的基础和制约因素。迄今发现或构建的微生物和工程菌株的木糖发酵生产性能仍然不能达到工业生产的要求,严重制约了植物纤维原料生物转化制取乙醇的产业化,寻求性能优良的木糖发酵菌株和研究微生物木糖代谢工程成为该领域的重点。本文利用分子标记技术对能够发酵木糖或植物纤维原料水解液的酵母菌种质资源进行了鉴定和亲缘关系研究,并通过转基因技术将不同酵母的优良遗传性能进行基因重组,构建出不同类型的表达质粒及木糖发酵重组酵母菌株,在此基础上开展了酵母木糖代谢工程的初步研究,主要研究结果如下: 　　除1 株Saccharomycess cerervisiae(OB20)以外,其余的假丝酵母属、管囊酵母属、毕赤酵母属、酒香酵母属、裂殖酵母属和酿酒酵母属等共6 个属20 个酵母菌株形态学和生理学特征与酵母菌检索表(Lodder,1970)一致,从而鉴定了上述酵母菌株的种质。在所鉴定的酵母菌株中,部分酵母属间的形态学和生理学特征差异比较明显,但种间的差异不明显,难以通过形态学和生理学进行酵母的种间分类鉴定。与传统的酵母菌分类鉴定方法相比,随机扩增多态性DNA(random amplified polymophisic DNA,RAPD)分子标记技术更精确简便,可直接或间接检测和鉴定遗传相对稳定的基因组DNA,能够更准确地反映酵母菌种间的亲缘关系,在酵母菌的分类鉴定上更具有优越性。共筛选出33 个RAPD引物,对6 个属21 株酵母菌株共扩增出498 条谱带,平均每个引物扩增出15.1 条谱带,其中多态位点高达90 %以上。RAPD分子标记的聚类分析结果表明,各酵母属间的RAPD结果差异显著, Candida shehatae NL 05与C. shehatae NL 01为同一种酵母菌株,它们与C. shehatae NL 02 之间的遗传距离仅为0.010。4 个酿酒酵母菌株的种间遗传距离低于0.100。2 个Candida sp. Berkh的种内遗传距离为0.020。2 个嗜单宁管囊酵母的种内遗传距离为0.070。Pichia stipitis NL03 和P. stipitis NL03 的种间遗传距离为0.052。休哈塔假丝酵母与热带假丝酵母之间遗传距离为0.114,它们聚类后与毕赤树干酵母之间遗传距离为0.493;粟酒裂殖酵母与卡斯伯酒香酵母的遗传距离为0.322;嗜单宁管囊酵母与克鲁斯假丝酵母间的遗传距离为0.383,它们与酿酒酵母间的遗传距离达到0.443,与产朊丝酵母聚类的遗传距离是0.471; Candida sp Berkh与其它酵母菌之间的亲缘关系较远,遗传距离达到0.567。该研究成果充实了酵母菌分类鉴定的数据资料,尤其是为植物纤维原料生物转化制取乙醇的微生物种质资源研究提供了理论依据。通过PCR 扩增成功获得毕赤树干酵母的木糖还原酶基因XYL1 和木糖醇脱氢酶基因XYL2 片段,它们的序列长度分别为1977 bp 和1910 bp,与GeneBank 公布的相关序列gi 3260 和gi 3262 序列的同源性分别达到98% 和99%。序列分析表明,XYL1 和XYL2

论文目录:

1. 前言

1.1 研究背景

1.1.1 乙醇生产的意义

1.1.2 生物乙醇的发展前景

1.2 立论依据

1.2.1 植物纤维原料生产生物乙醇

1.2.2 本研究的目的和意义

主要参考文献

2. 文献综述

2.1 植物纤维原料中的木聚糖

2.2 自然界中的乙醇发酵微生物

2.2.1 可直接转化植物纤维原料生成乙醇的微生物

2.2.2 可发酵葡萄糖生成乙醇的微生物

2.2.3 可发酵木糖生成乙醇的微生物

2.3 微生物的木糖代谢途径

2.3.1 木糖的跨膜转运

2.3.2 木糖转化成 5-磷酸木酮糖

2.3.3 磷酸戊糖途径

2.3.4 乙醇生成

2.4 木糖乙醇发酵工程菌株的构建

2.4.1 大肠杆菌

2.4.2 运动发酵单胞菌

2.4.3 毕赤树干酵母

2.4.4 酿酒酵母

2.5 分子标记技术在酵母菌分类鉴定中的应用

2.5.1 传统的酵母菌分类鉴定

2.5.2 分子标记技术与分子进化研究

2.5.3 分子标记技术在酵母菌分类鉴定中的应用

主要参考文献

3. 酵母菌的分类鉴定及亲缘关系研究

3.1 实验设计

3.1.1 酵母菌的传统分类鉴定

3.1.2 利用分子标记技术对酵母菌的分类鉴定和亲缘关系评价

3.2 材料与方法

3.2.1 酵母菌株

3.2.2 酵母菌的传统分类鉴定

3.2.3 酵母菌的基因组 DNA 提取

3.2.4 PCR 扩增反应及电泳分析

3.2.5 酵母菌的亲缘关系评价

3.3 结果与讨论

3.3.1 酵母菌的传统分类鉴定

3.3.2 利用 RAPD分子标记对酵母菌株的分类鉴定

3.3.3 酵母菌的亲缘关系评价

3.3.4 RAPD 分子标记技术应用于酵母分类鉴定研究的探讨

3.4 小结

主要参考文献

4. 木糖发酵重组酵母菌株的构建

4.1 实验设计

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株和质粒

4.2.2 PCR 扩增反应

4.2.3 电泳分析及凝胶纯化

4.2.4 限制性酶切和酶连接反应

4.2.5 质粒转化

4.2.6 重组酵母菌株的生理学特性鉴定

4.2.7 DNA 测序

4.3 结果与讨论

4.3.1 XYL1 和XYL2 的PCR扩增及序列分析

4.3.2 构建含有木糖代谢酶基因的系列表达质粒

4.3.3 构建含有木糖代谢酶基因的重组酵母菌株

4.4 小结

主要参考文献

5. 重组酵母菌株木糖发酵性能的研究

5.1 实验设计

5.2 材料与方法

5.2.1 酵母菌株

5.2.2 重组酵母菌株液体发酵

5.2.3 发酵过程的分析测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 重组酵母菌株的好氧发酵性能

5.3.2 重组酵母菌株的兼气发酵性能

5.3.3 重组酵母菌株的厌氧发酵性能

5.3.4 重组酵母菌株的 XR 和 XDH 酶活力检测

5.3.5 重组酵母菌株的木糖代谢性能评价与分析

5.3.6 进一步优化木糖代谢重组酵母菌株的探讨

5.4 小结

主要参考文献

6. 结论

附页

详细摘要

发布时间: 2005-12-30

参考文献

• [1].纤维素乙醇发酵过程中不同酵母菌株的比较脂组学研究[D]. 夏金梅.天津大学2010
• [2].适于木质纤维素原料产业化乙醇生产酿酒酵母菌株的代谢工程改造[D]. 李洪兴.山东大学2015

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