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HBV适应性杂交细胞株的建立和初步研究

2020-12-03阅读(926)

HBV适应性杂交细胞株的建立和初步研究

论文摘要

研究背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起严重肝脏疾病的病原体之一。据世界卫生组织报道,全球20多亿人曾感染乙肝病毒,其中约3.5亿人为慢性乙肝病毒感染者。慢性乙肝不易彻底治愈,并随着病情发展可恶化成肝硬化、肝癌。自1965年Blumberg等发现乙型肝炎病毒表面抗原,到1997年病毒全基因组的克隆和测序完成,人们对HBV的基因组成和抗原的结构、生物特性及其生命周期的认识迅速发展。但因缺乏体外增殖系统和易获得的细胞模型,HBV感染肝脏的早期机理研究进展较为缓慢,从而在一定程度上影响乙型肝炎及其相关肝脏疾病的基础和临床研究。由于人的肝组织来源有限,而且HBV病毒粘附以及DNA转录和复制对宿主有严格的限制,先前研究过的细胞模型又各存在其不可避免的缺陷。因此,建立一个近于自然感染状态即既适用于转染又可用血清中病毒颗粒直接感染,接近肝细胞生理状态并能稳定表达HBV抗原的细胞模型是急需的。本研究旨在通过将利用化学诱变剂诱导产生次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因突变的HepG2细胞与人原代肝细胞融合,建立杂交细胞株,这个杂交细胞株从细胞基因工程学理论上讲应该具有双亲遗传学特性,即既具有人原代肝细胞对HBV易感的特性又具有HepG2细胞能体外长期传代的特性。并对HBV在该杂交细胞的感染情况进行初步研究。目的建立不同于HepG2细胞及人原代肝细胞的新型杂交细胞株,使该细胞株既能长期携带HBV又能体外传代培养。方法诱导HepG2细胞产生HGPRT基因突变,将筛选出的HGPRT缺陷的HepG2细胞与携带HBV的人原代肝细胞进行融合得杂交细胞,用HAT培养基筛选出异核体杂交细胞,再利用有限稀释法进行克隆,通过核型分析方法鉴定所得细胞。对所得杂交细胞及培养上清液进行HBV DNA和HBsAg、HBeAg的检测。实验同时,用未杂交的HepG2细胞和人原代肝细胞作对照。结果经筛选后,有一杂交细胞株(HepCHLine3)克隆成功。HepCHLine3在形态学上与HGPRT缺陷HepG2细胞相似,能体外传代培养,染色体核型分析示HepCHLine3杂交细胞染色体众数为99条,证明为融合细胞株,含所有来自HepG2细胞和人原代肝细胞的基因数。传代培养的HepCHLine3及其培养上清液用巢式PCR可分别检测到HBV DNA,培养上清液内检测到HBsAg和HBeAg。对照组的HepG2细胞和人原代肝细胞相应结果为阴性。结果提示该细胞携带并分泌HBV DNA。结论该杂交细胞兼具HepG2细胞体外传代和人原代肝细胞对HBV易感的特性,是一新型杂交细胞株,为进一步建立新型HBV感染细胞模型奠定了基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 符号说明
  • 前言
  • 材料与原理
  • 仪器与设备
  • 实验理论基础
  • 方法与步骤
  • 第一部分 HGPRT缺陷HePG2细胞的诱导和筛选
  • 第二部分 人原代肝细胞的分离和培养
  • 第三部分 细胞融合和杂交细胞的筛选
  • 第四部分 杂交细胞的初步研究
  • 结果
  • 一、HGPRT缺陷HepG2细胞的诱导和筛选结果
  • 二、人原代肝细胞分离和培养结果
  • 三、细胞融合和杂交细胞筛选结果
  • 四、染色体核型分析结果
  • 五、杂交细胞生长曲线结果
  • 六、杂交细胞及培养上清液中HBV DNA的检测结果
  • 七、培养上清液中HBV抗原的检测结果
  • 讨论
  • 结论
  • 附图表
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的文章
  • 学位论文评阅及答辩情况表

    • 相关论文文献

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