论文摘要
目的:研究双表达TCRα12-2和TCRVβ7.1基因的重组腺病毒载体感染的PBMC对肝癌细胞的杀伤作用,为以后的TCR抗肿瘤研究奠定基础。方法:主要包括三方面:一、腺病毒穿梭质粒pDC315-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1的构建。提取外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）总RNA,RT-PCR得到TCRα12-2基因。TCRVβ7.1基因由pCDNA3.1-Vβ7.1扩增获得,将这两个基因以IRES相连克隆入腺病毒穿梭质粒pDC315中得到pDC315-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1。二、重组腺病毒Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1的包装及鉴定。穿梭质粒pDC315-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1和腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装出可同时表达TCRα12-2和TCRVβ7.1基因的重组腺病毒。然后提取病毒基因组DNA,对外源目的基因进行PCR鉴定;病毒感染宫颈癌细胞（HELA）,48小时后提取细胞总RNA,RT-PCR鉴定目的基因表达;最后病毒感染PBMC,用流式细胞仪检测目的蛋白的表达。鉴定正确的病毒命名为Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1并进行大量扩增,用TCID50法测定滴度。三、MTT和流式细胞仪检测Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染的PBMC对肝癌细胞的杀伤作用。用包装好的病毒Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1和对照病毒Ad-GFP分别感染PBMC,感染24小时后和未处理的PBMC分别作用于两株肝癌细胞BEL-7402和HepG2。48小时后用MTT和流式细胞仪检测杀伤效果。结果:酶切和测序结果证明腺病毒穿梭质粒pDC315-TCRα12-2-IRES-Vβ7.1构建正确并且包装成功。PCR从重组病毒基因组中扩增出目的基因TCRα12-2和TCRVβ7.1,说明目的基因整合到病毒中。RT-PCR和流式细胞仪检测表明目的基因可以有效的表达。Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染PBMC组对肿瘤细胞的杀伤率明显高于单独使用PBMC组和Ad-GFP感染PBMC组。结论:成功构建了双表达TCRα12-2和TCRVβ7.1基因的重组腺病毒载体Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1。Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1腺病毒感染后的PBMC可有效的杀伤肝癌细胞。
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标签：重组腺病毒载体论文;