基于荧光素类氨基荧光探针的γ-氨基丁酸类药物的色谱分析研究

论文摘要

高效液相色谱和毛细管电泳是两种有效的分离测定技术，而荧光检测器是色谱最常用的检测器之一。将高效液相色谱、毛细管电泳与荧光检测技术相结合的方法由于具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高等特点被广泛应用于生命科学、食品、环境等各个研究领域。γ-氨基丁酸类药物如加巴喷丁（GBP）、巴氯芬（BAL）、γ-氨基丁酸（GABA）等物质是在临床上应用较多的一类抗癫痫或治疗骨骼肌松弛的药物。γ-氨基丁酸类药物本身并没有荧光，无法直接用荧光检测器检测。若采用荧光衍生试剂对其进行衍生，使之转变成具有较强荧光的物质，可达到灵敏检测的目的。本论文选择了两种性能优良的荧光衍生试剂5-（4,6-二氯-s-三嗪-2-氨基）荧光素（DTAF）以及6-氧-（N-琥珀酰亚胺乙酸酯）-9-（2’-甲氧羰基）荧光素（SAMF），使之与γ-氨基丁酸类药物反应，进行标记后用高效液相色谱或毛细管电泳进行分析测定，完成了以下四个方面研究工作：（1）以本实验室合成的SAMF作为柱前衍生试剂，分别用高效液相色谱分离、紫外-可见（HPLC-UV-Vis）和荧光检测（HPLC-FLD）分析尿液和血液中的巴氯芬。在硼酸-硼砂缓冲溶液（pH=8.0）中，室温（25°C）下衍生15min后用色谱分离。HPLC-UV-vis法的线性范围为3×10-8mol L-1-5×10-6mol L-1，检测限为5×10-9mol L-1；HPLC-FLD的线性范围为1×10-10mol L-1-1×10-6mol L-1，检测限为5×10-10mol L-1。将该方法用于尿液和血液中巴氯芬含量的测定，结果令人满意。（2）以DTAF作为柱前衍生试剂，分别建立了毛细管电泳分离-激光诱导荧光（CE-LIF）和固相萃取-毛细管电泳分离-激光诱导荧光（SPE-CE-LIF）分析测定血浆中巴氯芬的两种方法。研究表明，在硼砂缓冲溶液（pH=9.0）介质中，40°C下45min即可完成衍生反应。在CE-LIF中，以γ-氨基丁酸做内标，20mmol L–1的硼砂缓冲溶液（pH=9.5）为背景电解质，分析物与内标的衍生产物峰在16min内达到基线分离，检出限为5×10-10mol L–1。在SPE-CE-LIF中，以二氯荧光素作为内标，40mmol L–1的硼砂缓冲溶液（pH=9.5）为背景电解质，衍生产物与内标的峰在22min内达到基线分离，检出限为1×10-11mol L（–1）。将新建立的方法用于血浆中巴氯芬分析测定，回收率为91.2-101.3%，结果令人满意。（3）采用SAMF、FITC、DTAF三种衍生试剂对三种γ-氨基丁酸类药物进行衍生，用CE-LIF进行分离测定，并详细比较了三种试剂在衍生条件、检测灵敏度方面的性能。研究表明，SAMF具有衍生条件温和、灵敏度高等优点。因此，以SAMF作为柱前衍生试剂，建立了SPE-CE-LIF分析测定血浆中加巴喷丁、巴氯芬和γ-氨基丁酸的新方法。当发射波长为473nm时，线性范围为4×10-10mol L-1-4×10-8mol L-1，检测限在2×10-11-3×10-11mol L-1之间（S/N=3）。将该方法用于血浆中加巴喷丁、巴氯芬、γ-氨基丁酸含量的测定，效果令人满意。（4）以DTAF为衍生试剂，建立了CE-LIF分析巴氯芬对映异构体的新方法。研究表明，在40mmol L-1的硼砂缓冲溶液（pH=9.0）中，45°C下40min即可完成衍生反应。以含有2mmol L-1羟丙基-β-环糊精的40mmol L-1硼砂缓冲溶液（pH=9.6）作为背景电解质，对映异构体衍生物在20min内达到分离，检出限为6×1010mol L-1。将新建立的方法成功地用于血浆以及药片中巴氯芬对映异构体的分析测定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 引言
• 1.2 色谱法分析检测γ-氨基丁酸类药物的研究现状
• 1.2.1 巴氯芬
• 1.2.2 加巴喷丁
• 1.3 固相萃取技术
• 1.4 荧光标记技术
• 1.5 本论文的选题思想和设计
• 2 高效液相色谱紫外可见和荧光检测法测定血浆和尿液中巴氯芬
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 衍生过程
• 2.2.3 稳定性实验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 衍生条件的优化
• 2.3.1.1 6-氧-（N-琥珀酰亚胺乙酸酯）-9-（2’-甲氧羰基）荧光素 （SAMF）浓度的影响
• 2.3.1.2 衍生 pH 的影响
• 2.3.1.3 衍生温度和时间的影响
• 2.3.2 色谱分离条件的优化
• 2.3.2.1 流动相比例的影响
• 2.3.2.2 流动相 pH 的影响
• 2.3.2.3 流动相流速影响
• 2.3.3 高效液相色谱分离-荧光检测
• 2.3.4 干扰试验
• 2.3.5 稳定性研究
• 2.3.6 标准色谱图，线性回归分析及检出限
• 2.3.7 分析应用
• 2.4 结论
• 3 毛细管电泳激光诱导荧光检测血浆中巴氯芬
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器及试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 衍生过程
• 3.2.2.2 血浆样品衍生过程
• 3.2.2.3 电泳条件
• 3.2.3 萃取过程
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 衍生条件的优化
• 3.3.1.1 DTAF 浓度的影响
• 3.3.1.2 缓冲溶液的影响
• 3.3.1.3 衍生温度和时间的影响
• 3.3.2 固相萃取条件的优化
• 3.3.2.1 萃取速度的影响
• 3.3.2.2 洗脱液的选择
• 3.3.2.3 洗脱液体积的优化
• 3.3.3 电泳分离条件的优化
• 3.3.4 标准电泳图、线性回归分析和检出限
• 3.3.5 分析应用
• 3.4 结论
• 4 柱前预处理毛细管电泳激光诱导荧光法同时测定血浆中三种γ-氨基丁酸类药物
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 衍生过程
• 4.2.2.1 以 SAMF 为衍生试剂的衍生过程
• 4.2.2.2 以 FITC 为衍生试剂的衍生过程
• 4.2.2.3 以 DTAF 为衍生试剂的衍生过程
• 4.2.2.4 样品处理及衍生
• 4.2.3 固相萃取过程
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 衍生试剂的选择
• 4.3.1.1 FITC 衍生条件的优化
• 4.3.1.2 DTAF 衍生条件的优化
• 4.3.1.3 SAMF 衍生条件的优化
• 4.3.1.3.1 6-氧-（N-琥珀酰亚胺乙酸酯）-9-（2’-甲氧羰基）荧光素浓度的影响
• 4.3.1.3.2 衍生 pH 的影响
• 4.3.1.3.3 衍生温度和时间的影响
• 4.3.1.4 SAMF 衍生条件的优化以及三种试剂的比较
• 4.3.2 内标的选择
• 4.3.3 固相萃取条件的优化
• 4.3.3.1 萃取速度的影响
• 4.3.3.2 洗脱剂的选择
• 4.3.3.3 洗脱液体积的优化
• 4.3.4 电泳分离条件的优化
• 4.3.4.1 电泳模式的选择
• 4.3.4.2 电泳缓冲溶液 pH 的影响
• 4.3.4.3 Brij-35 浓度的影响
• 4.3.4.4 乙腈体积百分比的影响
• 4.3.4.5 其它条件的影响
• 4.3.5 干扰试验
• 4.3.7 标准色谱图、工作曲线、线性回归分析、检出限及重现性
• 4.3.8 分析应用
• 4.4 结论
• 5 毛细管电泳激光诱导荧光检测血液和药片中巴氯芬对映异构体
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器及试剂
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 衍生过程
• 5.2.2.2 血浆样品衍生过程
• 5.2.2.3 巴氯芬片衍生过程
• 5.2.2.4 电泳条件
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 衍生条件的优化
• 5.3.1.1 DTAF 浓度的影响
• 5.3.1.2 缓冲溶液的影响
• 5.3.1.3 衍生温度和时间的影响
• 5.3.2 电泳分离条件的优化
• 5.3.3 标准电泳图、线性回归分析和检出限
• 5.3.4 分析应用
• 5.4 结论
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间研究成果
• 致谢