苹果APX、DHAR基因和猕猴桃GalDH基因的原核表达

论文摘要

抗坏血酸AsA作为一种重要的抗氧化剂,在植物细胞的酶促和非酶促反应中都具有重要意义。AsA在植物体内主要以AsA-GSH循环来发挥生物学功能,是植物体清除活性氧、抵御外界氧化胁迫的重要循环系统,对于保护叶绿体和其他细胞组分免受H2O2及其所产生的羟基自由基的破坏有很重要的意义。在这个循环中,抗坏血酸过氧化物酶（APX）和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）等协同控制着AsA代谢;APX是清除活性氧的关键酶,当植物体内的活性氧积累时,APX能催化AsA与H2O2反应而使H2O2被分解。DHAR以谷胱甘肽为底物,催化脱氢抗坏血酸还原为AsA,在循环利用AsA、保护细胞组分抵御氧化损伤中发挥重要的作用。在AsA中L-半乳糖合成途径中的L-半乳糖脱氢酶（L-GalDH）直接氧化半乳糖内酯形成AsA,是AsA合成的关键酶之一。本试验是在在本实验室前期研究工作的基础上,对抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶基因（DHAR,GenBan登录号DQ322706,嘎拉苹果叶片）和L-半乳糖脱氢酶基因（AlGalDH,GenBank登录号EU525846,阔叶猕猴桃）构建原核表达载体并诱导表达,为以后研究AsA代谢相关酶基因的功能奠定基础。主要研究结果如下:1、分别构建了APX,DHAR、AlGalDH基因的原核表达载体pET-APX,pET-DHAR和pET-AlGalDH,并转化表达宿主菌大肠杆菌BL21。2、对重组质粒pET-APX、pET-DHAR和pET-AlGalDH进行37℃条件下诱导剂IPTG不同浓度的诱导表达试验,结果发现重组质粒pET-APX在IPTG浓度为0.1 mmol·L-1,诱导时间为5h的目标蛋白诱导表达量最大;重组质粒pET-DHAR、pET-AlGalDH在IPTG浓度为0.1 mmol·L-1,诱导时间为6h的目标蛋白诱导表达量最大。3、进一步进行了低温条件下的诱导表达及蛋白可溶性分析,发现重组质粒pET-APX,pET-DHAR在20℃、IPTG浓度为0.1 mmol·L-1、诱导25h时的可溶性蛋白表达量最大;重组质粒pET-AlGalDH在IPTG浓度为0.1 mmol·L-1、15℃、20h时的可溶性蛋白表达量最大。4、用Promega公司的MagneHisTM Protein Purigication System试剂盒纯化重组质粒pET-APX、pET-DHAR和pET-AlGalDH诱导表达的可溶性蛋白,得到单一的条带,大小分别为53.0KD、46.0KD和55.0KD,并与目标蛋白大小一致。5、测得纯化的诱导重组质粒pET-APX、pET-DHAR和pET-AlGalDH表达蛋白酶活分别为127U·g-1、131U·g-1和120U·g-1。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 植物抗坏血酸的研究进展

1.1.1 植物中抗坏血酸的生物学功能

1.1.1.1 抗坏血酸作为抗氧化剂保护植物体免受氧化损伤

1.1.1.2 抗坏血酸在植物抵抗其它逆境胁迫时的作用

1.1.1.3 抗坏血酸在细胞壁代谢和细胞膨大中的作用

1.1.1.4 抗坏血酸在细胞分裂和分化中的作用

1.1.1.5 参与其它物质的合成

1.1.2 植物抗坏血酸的生物合成途径

1.1.2.1 邻酮醛糖合成途径

1.1.2.2 碳链倒位途径

1.1.2.3 L-半乳糖途径

1.1.2.4 可能的交替途径：糖醛酸转变途径

1.1.3 植物抗坏血酸的调控机制

1.1.4 植物抗坏血酸的代谢和转运

1.2 植物抗坏血酸过氧化物酶（APX）的研究进展

1.3 植物脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的研究进展

1.4 植物的L-半乳糖内酯脱氢酶（L-GALLDH）的研究进展

1.5 外源基因原核表达的研究进展和应用现状

1.5.1 原核表达载体

1.5.2 目的蛋白在原核表达中的形式

1.5.3 大肠杆菌表达系统研究的新进展

1.6 本研究的目的和意义

第二章材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌种与载体

2.1.2 酶及生化试剂

2.1.3 引物的设计与合成

2.1.4 主要仪器设备

2.2 试验内容及方法

2.2.1 原核表达载体的构建

2.2.1.1 APX 基因原核表达载体的构建

2.2.1.2 DHAR 基因原核表达载体的构建

2.2.1.3 GALDH 基因原核表达载体的构建

2.2.2 37℃条件下不同浓度IPTG 对转化子的诱导表达

2.2.3 诱导蛋白的可溶性分析

2.2.4 转化子不同温度、IPTG 浓度和不同时间的诱导表达和表达蛋白的可溶性分析

2.2.5 可溶性目标蛋白的纯化

2.2.6 纯化蛋白的酶活测定

2.2.6.1 APX 基因表达蛋白纯化的酶活测定方法

2.2.6.2 DHAR 基因表达蛋白纯化的酶活测定方法

2.2.6.3 ALGALDH 基因表达蛋白纯化的酶活测定方法

第三章结果与分析

3.1 苹果APX 基因的原核表达

3.1.1 原核表达载体的构建

3.1.2 苹果APX 基因的诱导表达SDS-PAGE 分析

3.1.3 低温诱导及蛋白可溶性分析

3.1.3.1 重组质粒PET-APX 在37℃条件下诱导表达的总蛋白的可溶性分析

3.1.3.2 低温条件下重组质粒PET-APX 的诱导表达蛋白的可溶性分析

3.1.4 重组质粒PET-APX 诱导表达的可溶性蛋白的纯化

3.1.5 纯化的重组质粒PET-APX 的诱导表达蛋白的酶活测定

3.2 苹果DHAR 基因的原核表达

3.2.1 苹果DHAR 基因原核表达载体的构建

3.2.2 重组质粒PET-DHAR 的诱导表达及SDS-PAGE 分析

3.2.3 低温诱导及蛋白可溶性分析

3.2.3.1 重组质粒PET-DHAR 在37℃条件下诱导表达的总蛋白的可溶性分析

3.2.3.2 低温条件下重组质粒PET-DHAR 的诱导表达蛋白的可溶性分析

3.2.4 重组质粒PET-DHAR 诱导表达的可溶性蛋白的纯化

3.2.5 纯化的重组质粒PET-DHAR 诱导表达的可溶性蛋白的酶活测定

3.3 阔叶猕猴桃GALDH 基因的原核表达

3.3.1 原核表达载体的构建

3.3.2 猕猴桃ALGALDH 基因的诱导表达与SDS-PAGE 分析

3.3.3 重组质粒PET-ALGALDH 低温诱导表达及蛋白可溶性分析

3.3.3.1 重组质粒PET-ALGALDH 在37℃条件下诱导表达的总蛋白的可溶性分析

3.3.3.2 低温条件下重组质粒PET-ALGALDH 的诱导表达蛋白的可溶性分析

3.3.4 重组质粒PET-ALGALDH 诱导表达的可溶性蛋白的纯化

3.3.5 纯化的重组质粒PET-ALGALDH 诱导表达的可溶性蛋白的酶活测定

第四章讨论

4.1 关于原核表达载体的选择

4.2 原核表达宿主菌的选择

4.3 重组质粒的诱导表达

4.4 可溶性蛋白的纯化

第五章结论

5.1 载体的构建

5.2 重组质粒PET-APX 的诱导表达

5.3 重组质粒PET-DHAR 的诱导表达

5.4 重组质粒PET-ALGALDH 的诱导表达

参考文献

致谢

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苹果APX、DHAR基因和猕猴桃GalDH基因的原核表达

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