论文题目: 冷冻干燥人脐带血的集落培养和形态分析
论文类型: 硕士论文
论文专业: 制冷与低温工程
作者: 李军
导师: 华泽钊
关键词: 冷冻干燥,人脐带血,单核细胞,细胞培养
文献来源: 上海理工大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究在国家自然科学基金重点项目“临床医学中生物体冷冻与加热过程中的热物理问题研究”和上海市教委重点学科项目的资助下,对脐带血中的造血干细胞进行了冷冻干燥的保存研究。本文在保证无菌的条件下,对人脐血分离单核细胞MNC(单核细胞)的冻干效果进行了比较分析,精确测得了剩余水分含量,并对冷冻干燥后的脐带血进行了细胞培养和显微观察,为有关血液细胞的冷冻干燥保存研究提供了有用的信息。脐带血中含有丰富的造血细胞,作为骨髓、外周血后的第三种造血干细胞的来源,正日益受到人们的重视,已经成为异基因骨髓移植的一种替代方法,并显示出其巨大的潜力,成为近十年来造血干细胞移植领域中最重大的进展之一。脐带血中的造血干细胞有着广泛的应用前景,随之而产生的保存问题已成为关注的热点。目前已有许多关于脐血低温保存的研究,但国内外很少有人对脐血的冻干保存进行研究。在前人的研究中,以不同浓度的蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇等作保护剂,加入到有核细胞和全血当中,经3小时冻结至-38℃,在-30℃下进行一次干燥38小时,15℃搁板温度下进行二次干燥11小时。冻干后的样品用流式细胞仪分别进行PI染色活性检测和CD34+抗原跟踪检测,结果发现:有核细胞的冻干效果比全血要好;脐血单核细胞MNC的冷冻干燥恢复率最高达到75%,在已恢复的单核细胞中具有细胞活性的占98.57%, CD34+细胞恢复率最高达到59%;脐血全血有核细胞的冻干恢复率为39%。但是在已报道的实验研究中无法保证无菌操作。本研究通过一系列的消毒、灭菌措施保证整个实验过程的无菌操作,为细胞培养实验创造了条件。通过冻干后细胞恢复率的结果分析了胎牛血清的冻干保护效果,并测量了样品的剩余水分含量。在本研究中,添加不同保护剂的脐带血有核细胞先被冻结至-38℃,在-30℃下进行一次干燥31小时,15℃搁板温度下进行二次干燥9小时。对于冻干产品来说,剩余水分含量会影响产品的保存时间,因此有必要检测冻干后的样品中的剩余水分含量。本论文首次使用热重分析天平测得了冻干后的样品剩余水分含量测量,样品的剩余水分含量为6.5±0.87%,相应的细胞存活率提高了8%。细胞恢复率的研究结果表明:牛血清作为冻干保护剂存在一个最佳的浓度,当浓度超过10%时,细胞恢复率会相应减小。为了研究冻干后的细胞活性,首次尝试了冻干后单核细胞的粒-单核细胞系祖细胞(CFU-GM)集落培养。经过7天的培养后,仍有40%左右的细胞存活,并且形成了较小的细胞集落,但是没有发现较大的细胞集落。同时,从培养后的结果可以看出,培养后没有出现细菌,整个冻干和细胞培养实验过程实现了无菌操作的要求。首次使用透射电镜对冻干前后的细胞进行比较分析,观察到了细胞内部结构在冻干前后的变化。通过分析可以看出,冻干复水后的细胞,细胞膜保持完整,细胞形态一致,细胞质有所减少。本文的研究成果已在英国期刊CryoLetters上发表。
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 脐带血相关知识
1.1.1 脐带血中的造血细胞
1.1.2 脐血移植的优势
1.1.3 脐血干细胞移植的临床应用
1.2 脐血保存的现状
1.2.1 脐血全血的冻存
1.2.2 脐血单个核细胞（Mononuclear Cells, MNC）低温保存
1.2.3 脐血CD34~+细胞的冻存
1.3 脐血库的历史和现状及存在的问题
1.4 冷冻干燥技术
1.4.1 冷冻干燥技术的优点
1.4.2 冷冻干燥技术的基本程序
1.5 冷冻干燥保存血液细胞的研究现状
1.6 本文的主要研究内容
第二章 实验设备
2.1 实验用冻干设备简介
2.2 制冷系统
2.3 真空系统
2.4 加热系统
2.5 温度测量及记录系统
2.6 工艺参数
2.7 本章小结
第三章 消毒灭菌的措施
3.1 常用的消毒灭菌方法及其原理
3.1.1 消毒、灭菌的原则
3.1.2 消毒、灭菌的方法
3.2 无菌处理
3.2.1 冻干过程中细菌感染的途径
3.2.2 无菌处理的方法
3.3 本章小结
第四章 冷冻干燥保存单核细胞的研究
4.1 冷冻干燥过程
4.1.1 实验标本来源
4.1.2 脐血单核细胞的分离
4.1.3 脐血单核细胞冻干过程中冻干保护剂配方
4.1.4 脐血分离单核细胞冻干悬浮液配置
4.1.5 冷冻干燥工艺参数
4.2 冻干样品的剩余水分含量
4.3 胎牛血清对细胞恢复率的影响
4.4 容器对冻干效果的影响
4.5 本章小结
第五章 冻干后单核细胞的集落培养
5.1 细胞培养概述
5.1.1 细胞培养的分类
5.1.2 培养细胞的生长方式
5.1.3 细胞培养液的组成
5.1.4 造血祖细胞培养的种类
5.2 细胞刺激因子PHA-LCM
5.2.1 试剂的配置
5.2.2 培养因子的制备
5.3 冻干复水后脐血单核细胞的CFU-GM 集落培养
5.3.1 细胞培养
5.3.2 培养后的显微分析
5.4 本章小结
第六章 人脐血分离单核细胞冻干前后的细胞形态研究
6.1 细胞的基本知识
6.2 实验材料与方法
6.2.1 实验材料
6.2.2 实验装置及原理
6.3 实验结果
6.4 本章小结
第七章 结论与展望
7.1 主要结论
7.2 展望与建议
参考文献
在读期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果
致谢
发布时间: 2007-12-27
参考文献
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