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H5亚型禽流感病毒广谱治疗性单抗13D4中试工艺的建立，及其晶体培养与表位预测

2020-12-02阅读(931)

H5亚型禽流感病毒广谱治疗性单抗13D4中试工艺的建立，及其晶体培养与表位预测

论文摘要

高致病性禽流感（Avian influenza,AI）是由A型流感病毒H5N1引起的烈性传染病。近年来,该疾病随着候鸟迁徙不断向各国传播,在造成巨大的经济损失的同时,也引起了多例人感染禽流感的病例,因此,对禽流感防治手段的研究引起了广泛重视。中和单抗是防治病毒性疾病的一种很有效手段。但是由于禽流感病毒基因突变频率高,尤其以血凝素（HA）基因为最,因此针对禽流感病毒的中和单抗中和谱较窄,往往只能中和少数遗传变异亚系的病毒,这就极大限制了这些中和单抗的应用。本实验室所制备的单抗13D4具有广谱中和活性,能有效中和41株不同遗传变异亚系的H5N1病毒代表株,在禽流感的防治中具有广阔的应用前景。本研究通过实验摸索,建立了一套低成本,简便高效的13D4全抗体和F（ab）’2的纯化制备方法,在中试规模生产中能够制备出符合国家检定标准的产品,纯度达到99%左右,得率为60%,为该抗体药物的成功奠定了基础。为了进一步揭示13D4广谱中和活性的机制,本研究还进行了13D4 Fab片段晶体的培养。通过对13D4 Fab片段培养条件的筛选和优化,制备出了能用于X射线晶体衍射的单晶。另外,本研究还通过分子模拟的方法,得到了抗体13D4 Fab片段以及A/Ck/HK/Yu22/02（H5N1）HA1的三维结构,并通过Fab分子依次与已有晶体结构的3个H5亚型HA以及模拟的HA1分子进行对接,预测单抗13D4可能结合表位为:由13个Glu112,Lys113,Ile114,Pro118,Ser120,Ser121,Ser123,Lys161t,Arg162,Ser163,Tyr164,Asn168,Lys255不连续氨基酸残基组成的构象表位。还利用分子对接结果分析H5亚型禽流感的广谱中和表位和,综合单个Fab分子与4个HA分子的对接结果用于寻找该单抗识别的HA抗原表位,用于寻找与抗原良好契合的多肽结构。13D4 Fab片段上可能用于治疗禽流感的多肽片段为Gln27-Thr28-Ser31-Gly31-Leu52-Gly54-Ser55-Asn57-Thr100-Thr101-Ala102-Val103。

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语
  • 第一章 前言
  • 一.禽流感病毒
  • 1.1 禽流感病毒的形态特征及其化学组成
  • 1.2 禽流感病毒基因组和主要蛋白的功能
  • 1.3 HA蛋白的结构和功能
  • 1.4 禽流感病毒的流行与危害
  • 1.5 禽流感的防治
  • 二.治疗性单克隆抗体
  • 2.1 治疗性单克隆抗体的历史
  • 2.2 单克隆抗体的结构和作用机理
  • 2.3 单克隆抗体的分类
  • 2.4 H5亚型禽流感病毒的广谱治疗性抗体
  • 三.蛋白质结晶学
  • 3.1 蛋白质晶体学发展历史
  • 3.2 蛋白质的结晶原理和方法
  • 3.3 影响蛋白质晶体生长的因素
  • 3.4 蛋白质结晶条件的筛选和优化
  • 四.蛋白质结构预测
  • 4.1 蛋白结构预测方法的迫切需要及其诞生
  • 4.2 理论计算方法在蛋白质空间结构模建中的应用
  • 4.3 基于蛋白质结构认识的结构预测
  • 4.4 蛋白结构预测在抗体模拟上的应用
  • 五.本论文的研究目的,思路及意义
  • 5.1.研究的目的和思路
  • 5.2.研究的意义
  • 第二章 材料与方法
  • 一.仪器
  • 二.材料
  • 2.1 腹水与单抗
  • 2.2 基因序列及其蛋白晶体结构
  • 2.3 其他试剂
  • 2.4 常用溶液配制
  • 三.方法
  • 3.1 利用切向流装置改变缓冲液体系
  • 3.2 饱和硫酸胺沉淀
  • 3.3 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳（SDS—PAGE）
  • 3.4 AKTA色谱纯化
  • 3.5 抗体Fab片段制备及纯化
  • 3.6 分子筛层析分析
  • 3.7 毛细管电泳分析
  • 3.8 抗体原液的检定规程
  • 3.9 蛋白质晶体培养
  • 3.10 抗体模拟
  • 3.11 模型合理性验证
  • 3.12 抗体和HA抗原的分子对接
  • 3.13 复合物溶剂可及表面分析和表位确定
  • 3.14 与HA抗原保守表位区域结合的抗体多肽
  • 第三章 结果与分析
  • 第一部分 13D4全抗体的纯化工艺的建立及其F（ab）'2片段制备与纯化的摸索
  • 一.13D4全抗体的纯化工艺的建立
  • 1.1 13D4单抗初级分离纯化条件的摸索
  • 1.2 13D4单抗精制分离纯化条件的摸索
  • 1.3 13D4单抗原液检定小结
  • 二.13D4单抗F（ab）'2片段制备与纯化
  • 2.1 13D4单抗F（ab）'2片段制备
  • 2.2 13D4单抗F（ab）'2片段纯化
  • 三.第一部分小结
  • 第二部分 13D4单抗Fab片段的结晶
  • 一.样品的准备
  • 二.13D4单抗Fab片段的结晶条件的初筛
  • 三.13D4抗体Fab片段的结晶条件的优化
  • 3.1.基于30%（w/v）PEG 1500条件的优化
  • 3.2 基于20%（w/v）PEG 3350,0.2 mol/L KAc条件的优化
  • 3.3 对最优条件的油滴法优化
  • 3.4 晶体大小的测量与验证
  • 四.第二部分小结
  • 第三部分 抗体13D4 Fab片段结构模拟及其结合位点预测
  • 一.抗体13D4 Fab以及YU22 HA1的同源模建
  • 1.1 模板的选取
  • 1.2 13D4 Fab以及YU22 HA1的分子模建
  • 二.结构评测
  • 2.1.能量分析
  • 2.2.SAS值分析
  • 2.3.氢键分析
  • 2.4.二面角分析
  • 2.5.Profiles-3D分析
  • 三.分子对接及其表位分析
  • 3.1 抗体13D4Fab和HA抗原分子对接模式
  • 3.2.HA蛋白抗体13D4Fab表位的分析
  • 四.抗H5禽流感病毒药物的初步探索
  • 4.1.抗H5禽流感多肽药物设计的基础
  • 4.2.抗体13D4Fab中与HA中和表位区域结合的多肽
  • 五.第三部分小结
  • 第四章 讨论
  • 第五章 小结与展望
  • 一.小结
  • 二.展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 硕士期间发表文章

    • 相关论文文献

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