替尼类药物耐药机制及NO供体型化合物克服肿瘤耐药研究

论文摘要

背景：癌症是威胁人类健康的第一杀手，而化疗是癌症治疗的重要手段，在临床治疗中由于多药耐药（Multidrug resistance, MDR）的出现，造成化疗的失败。因此，探究药物产生耐药性的原因和寻找有效的克服耐药的药物显得尤为重要。众所周知，人类多种常见癌症中均有EGFR高表达，其中包括我国高发的肝癌，近年来分子靶向药物EGFR-TKI开始试用于治疗晚期肝癌，个别药物取得了突破性进展，但是其潜在的耐药问题值得我们关注；最近有研究显示NO能克服经典ABC转运蛋白介导的耐药。基于以上两个方面，本研究旨在研究靶向EGFR的TKI艾洛替尼、吉非替尼和凡德他尼在肝癌HepG2细胞中潜在的耐药机制，并对NO供体型化合物AB-19在克服耐药肿瘤的活性和机制进行评价研究。1.替尼类药物耐药机制目的：体外建立人肝癌艾洛替尼、吉非替尼和凡德他尼耐药的细胞株HepG2/Erlotinib、HepG2/Gefitinib和HepG2/Vandatinib，鉴定其生物学特性，并对其耐药机制进行初步探讨。方法：以逐步递增联合大剂量药物冲击方法，在体外连续诱导培养人肝癌细胞HepG2，建立替尼类药物耐药的细胞株HepG2/Erlotinib、HepG2/Gefitinib和HepG2/Vandatinib。以SRB法测定其耐药倍数和耐药谱，测定细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间，流式细胞术检测其细胞周期，以RT-PCR和Western blot方法检测耐药细胞中耐药基因bcrp基因及其蛋白BCRP的表达，用流式细胞术检测细胞表面BCRP蛋白表达，并用基因芯片和双向电泳对耐药细胞HepG2/Gefitinib和敏感细胞HepG2进行鉴定，对其耐药机制进行研究。结果：成功建立了人肝癌细胞靶向药物EGFR-TKI的耐药细胞株HepG2/Erlotinib、HepG2/Gefitinib和HepG2/Vandatinib，它们产生了原药4-10倍的低倍耐药，其对顺铂、紫杉醇、阿霉素、米托蒽醌和拓泊替康有交叉耐药性，而HepG2/Erlotinib对紫杉醇保持敏感；耐药细胞倍增时间变长，流式细胞分析表明耐药细胞比敏感细胞S期和G2/M期比例增高，G0/G1期比例减少，经过RT-PCR，Western blot和流式细胞术检测，耐药细胞中bcrp基因和BCRP蛋白表达升高，对耐药细胞HepG2/Gefitinib和敏感细胞HepG2的基因芯片和双向电泳结果显示耐药细胞耐药性的产生可能与上调的基因或蛋白有关，深入的机制研究还在进行中。结论：建立的人替尼类药物耐药的细胞株HepG2/Erlotinib、HepG2/Gefitinib和HepG2/Vandatinib具有耐药细胞的特征和生物学特性，其耐药机制与细胞中BCRP蛋白的上调有关，也可能与鉴定出来差异基因或蛋白相关。2. NO供体型化合物克服肿瘤耐药研究目的：研究NO供体型化合物AB-19对经典耐药相关蛋白介导的耐药和相应敏感细胞的细胞毒性，以及克服肿瘤耐药的机制。方法：采用MTS和SRB法测定对耐药及敏感细胞（HEK293/BCRP、HEK293/MRP1和HEK293/vector，K562/A02和K562）以及肝癌细胞与正常肝细胞的（HepG2和LO2）的细胞毒性；应用NO检测试剂盒测定NO释放与活性的关系，并考察加入NO清除剂（Hemoglobin）后对抗肿瘤活性的影响；采用FACS检测AB-19对P-gp，BCRP逆转功能影响；Western blot检测AB-19对P-gp，BCRP及相关信号通路进行检测。结论：NO供体型化合物AB-19对耐药和敏感细胞具有较强的、相似的细胞毒作用，对肝癌细胞毒性大于正常肝细胞；对MDR-ABC耐药相关蛋白BCRP，P-gp没有逆转、降解和增敏作用；机制研究表明，AB-19通过释放高浓度NO来杀伤敏感/耐药细胞，且对信号通路分子AKT、ERK、NF-κB无作用，而对p-AKT、p-ERK、p-NF-κB和HIF-1α有显著作用，并呈时间和剂量依赖性，为克服耐药肿瘤研究提供新的途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分
• 1.1 引言
• 1.2 实验材料
• 1.2.1 药物和试剂
• 1.2.2 实验仪器
• 1.2.3 细胞系与细胞培养
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 耐药细胞株的建立与鉴定
• 1.3.2 耐药机制研究
• 1.3.3 统计学处理
• 1.4 实验结果
• 1.4.1 耐药细胞株的建立与鉴定
• 1.4.2 耐药机制研究
• 1.5 讨论
• 第二部分
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 药物和试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 细胞系与细胞培养
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 NO 供体型化合物 AB-19 细胞毒实验
• 2.3.2 NO 供体型化合物 AB-19 克服耐药机制研究
• 2.3.3 统计学处理
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 NO 供体型化合物 AB-19 细胞毒实验
• 2.4.2 NO 供体型化合物 AB-19 克服耐药机制研究
• 2.5 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及专利目录
• 附文
• 致谢