论文摘要
钙是人体健康和长寿的不可缺少的重要金属元素,在人体中约占总体重的1.5%～2.0%。它在人体神经、肌肉应激、神经冲动传导、心脏节律维持、血液凝固、细胞粘着等生理过程中发挥着极其重要的作用。人体缺钙将可能引起诸多疾病。人体对钙的吸收率还受多种因素的影响。国外学者研究指出,不论哪种肤色的人群都被缺钙威胁。美国国家科学学会（National Academic of Science）推荐成人每人每天1,000-1,200mg。1988年我国营养学会修订的成人钙供应量为:成人每日800mg,孕妇、青少年、老年人每日1,200mg,然而,我国人民钙的实际摄入量普遍偏低,2002年第四次营养调查结果显示,我国人群日常钙的摄入量仅达推荐量的一半。因此,补钙食品的研制具有十分重要的意义。骨骼在动物体中约占体重的20%～30%,是一种营养价值非常高的肉类加工副产物,含有大量的蛋白质、脂质、矿物质等营养成分,特别是含钙丰富。动物骨骼中的钙是以羟磷灰石晶体[Ca10（PO4）6（OH）2]和无定型磷酸氢钙（CaHPO4）的形式存在。羟磷灰石晶体[Ca10（PO4）6（OH）2]和无定型磷酸氢钙（CaHPO4）被大量的胶原纤维紧密包裹,形成致密的组织。人体要以动物骨头为钙源,就必须将这种致密的组织破坏。微生物在生长繁殖过程中,不断进行着能量和物质的交换。金属离子既是其生长所需的生长因子,也可能是生长干扰因素。尽管单个菌体吸收的金属量仅占菌体干物质的0.5%～1.0%左右,但是微生物繁殖量大,生长速度快,而且可以通过自身代谢的高分子物质结合金属。利用这种特性,工业上首先在污水处理上出现了利用微生物富集重金属,进而在食品领域也出现了利用菌体富集人体所需的离子态金属元素。研究表明,改变如铁、锌、硒等微量元素的化合态形式更利于吸收和利用,而且食用安全性也提高了。乳酸菌是对人体有益的肠道菌群,可以防止和阻碍其他肠道的腐败菌产生对人体有害的物质;能刺激巨噬细胞的吞噬能力,提高人体免疫能力和具有降低血脂和胆固醇的功能。此外,研究发现乳酸菌对一些金属元素（如:铁）具有一定的富集作用。目前,国内外将动物骨泥（粉）加工成食品的研究逐渐增多,但成功开发出保健食品的报道较少,而利用乳酸菌发酵骨泥开发增强骨密度保健食品并对其功能性的研究尚未见报道。目前,国内外大多将其用于餐饮业和大量用于饲料工业或工业燃料,不能有效地利用好骨泥（粉）这一宝贵资源,造成大量蛋白质及钙磷营养物质的浪费。本论文系统地研究了以动物骨骼为主要原料,应用超微粉碎、乳酸菌发酵、酶处理等技术相结合,开发具有增强骨密度功能的新型乳酸菌发酵骨泥保健食品。研究内容主要包括三个方面:一、筛选出钙富集量较高的乳酸菌菌株,探讨乳酸菌对钙的富集作用,奠定其发酵骨泥的可行性;二、研究超微粉碎骨泥的加工特性、乳酸菌发酵骨泥的工艺条件优化和发酵骨泥的保健功能,为进一步开发生物态保健食品提供实验数据和理论依据:三、以发酵骨泥为主要原料开发高钙保健食品,研究其卫生学、稳定性、毒理学和功能试验,探明骨泥食品的安全性和功能性。具体研究内容和结果如下:1、乳酸菌与钙的富集作用研究通过研究保加利亚乳杆菌（Lactobacillus Bulgaria LB）、干酪乳杆菌干酪亚种Lactobacilluscasei LC)、短乳杆菌（Lactobacillus brevis Lb）、乳酸乳杆菌（Lactobacillus lacticLL）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus LA）、植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum LP）6种乳酸菌的生长性能、产酸性能以及对钙的富集能力,发现LC菌株效果相对较好。以LC为实验菌株研究发现,在含钙1.2mg/mL（以氯化钙为钙源）的MRS培养基中,钙富集量达1.02μg/mg湿菌体。乳酸菌富集钙的主要时期是在其细胞大量增殖的对数生长期,此期间富集钙的量达到整个富集量的78%;高浓度钙离子（12mg/mL）对乳酸菌生长有一定的延迟和抑制作用。钙离子浓度从1mg/mL增加到8mg/mL,钙富集量从0.98μg/mg增加到1.37μg/mg,乳酸菌富集钙的量随培养基中钙离子浓度的增加而增加,但增加趋势逐渐减缓;钙离子浓度为3mg/mL时,以氯化钙为钙源,乳酸菌钙富集量为1.2μg/mg湿菌体,分别比以碳酸钙和磷酸钙为钙源高0.3μg/mg和0.22μg/mg:乳酸菌在42℃时培养时,钙富集量高于37℃:乳酸菌菌体细胞富集的钙58%分布在细胞壁,42%分布在细胞质;富集钙乳酸菌在模拟胃环境中能逐渐释放出富集的钙,并显示出一定的缓释效应。2、超微猪骨泥的加工及理化特性研究通过研究得到,选择2次添加-4℃的冰水,添水量为“骨:水=1:1”,钢磨间隙为“粗磨2圈+细磨1圈”,进行二次细粉碎,可以使大部分骨粒的大小从一次细粉碎后的90μm减小到55μm。超微鲜骨泥中水分含量与牛肉水分含量相近,约为75%;蛋白质含量较高,达12.3g/100g;脂肪含量为5.2%,相对较低;钙含量在金属元素中含量最高,达783.5mg/100g（牛奶含钙约120mg/100g）,除去水和脂肪,钙含量达3917.5mg/100g。通过对影响骨泥粘度因素的研究,发现不同添水量、温度、不同添加物、不同pH、高温高压处理、酶处理都在不同程度上影响骨泥的粘度。其中,高温高压处理、酶处理在降低骨泥粘度上有显著效果。木瓜蛋白酶水解和高温高压共同作用,使骨泥氨基酸态氮显著提高,从52.65mg/100g提高到123.4 mg/100g;游离钙含量增加,占总钙（783.5mg/100g）的1.3%,提高了一倍;但对骨泥pH影响相对不大。3.乳酸菌发酵超微猪骨泥的工艺及功能研究乳酸菌发酵超微猪骨泥的最优发酵工艺为:添加0.03%的木瓜蛋白酶在65℃下保温1h,并冷却去脂肪,添加5%的碳源（葡萄糖:蔗糖=3:7）,15%超微粉碎西红柿泥,灭菌后,接种乳酸乳杆菌与植物乳杆菌（1:1）双菌株发酵,接种量为4%,在37℃振荡培养20h后,42℃下再静止发酵16h。通过乳酸菌发酵木瓜蛋白酶水解过的超微骨泥,氨基酸态氮先降低,后期略有提高（发酵前:123.4 mg/100g,发酵32h:58.67 mg/100g,发酵48h:66.8 mg/100g）。显微镜观察鲜骨泥和发酵骨泥粒度变化,发现骨泥发酵后粒度明显减小。通过0.45μm微孔滤膜过滤和LSA—10吸附树脂分析乳酸菌发酵超微骨泥前后,钙初级形态变化,发现乳酸菌发酵有利于可溶性钙显著提高。可溶性钙从12.6 mg/100g提高到138.8 mg/100g,钙溶出率达17.6%;其中有机态钙含量从5.6 mg/100g提高113.1mg/100g,占可溶性钙的81.5%。通过对Wistar雄性大鼠饲喂未发酵鲜骨泥和发酵超微骨泥,结果显示,发酵超微骨泥在增强大鼠股骨密度功能上显著高于未发酵鲜骨泥（P＜0.05）。从而,为应用发酵超微骨泥开发保健食品奠定了可行性和必要性。4.生物骨钙胶囊保健食品研究利用乳酸菌发酵骨泥为主要原料,采用喷雾造粒技术,加工生物骨钙胶囊保健食品,确定了加工工艺及配方。2.8kg发酵骨泥中添加0.6mg维生素D3,溶解后作为喷雾液,母核为1.4kg食品级碳酸钙和60g酪蛋白磷酸肽混合物。母核置流化床内预先流化干燥30min后,进行喷雾造粒。喷雾造粒进风温度和进料频率分别选择80℃和60Hz。胶囊充填参数选择0.6 MPa,充填量为0.25g/粒。胶囊单瓶装量为100粒/瓶,装瓶速度为50瓶/min,封口温度为180℃。生物骨钙胶囊保健食品中发酵骨泥干物质含量为30%以上,其中15%以上为骨蛋白（包括氨基酸和多肽）:钙含量约280mg/g,其中含来源于发酵骨泥的高活性钙约12mg/g;维生素D3含量约为3μg/g,酪蛋白磷酸肽含量约为30mg/g。推荐每人每日3次,每次2～3粒。5.生物骨钙胶囊保健食品卫生学及稳定性试验研究生物骨钙胶囊经卫生学检验,钙含量达27.5g/100g,维生素D含量为2.9μg/g,产品中蛋白质含量较高,达17%。砷＜1mg/kg、汞＜0.1mg/kg、铅＜1.5mg/kg,菌落总数＜180cfu/g,酵母菌＜5cfu/g、霉菌＜5cfu/g、大肠菌群＜30 MPN/100g,致病菌（沙门氏菌、致贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）未检出。达到《保健食品管理办法》要求蛋白质高于4%的胶囊类保健食品理化指标和微生物指标要求。37℃,75%相对湿度下进行三个月保温试验,结果显示各指标均保持稳定。6.生物骨钙胶囊保健食品毒理学试验研究生物骨钙胶囊做毒理学试验包括急性毒理学试验、三项致突变试验（Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验）和30天喂养试验。结果显示:生物骨钙胶囊对两种性别的大、小鼠的MTD均大于15000mg/kg.bw,说明该产品属无毒物;三项致突变试验结果阴性;大鼠30天喂养试验各项指标均未见异常。7.生物骨钙胶囊保健食品功能试验研究生物骨钙胶囊增强骨密度的功能试验研究结果得到:生物骨钙胶囊对大鼠体重没有显著影响（P＞0.05）。给予375 mg/kg.bw、1125 mg/kg.bw的生物骨钙胶囊可使大鼠的股骨钙含量、股骨密度显著高于低钙对照组和等剂量的碳酸钙对照组（P＜0.05）。根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）中对增加骨密度功能实验的判定方法,判定生物骨钙胶囊有增加骨密度功能的作用。
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