利用荧光共振能量转移研究DNA聚合酶作用机理及DNA单碱基突变分析

论文摘要

DNA聚合酶在DNA复制、重组和碱基切除修复过程中起着重要的作用,脱氧核糖核酸是主要的遗传物质,具有重要的生物功能,在生物体的生命活动中起着重要的作用,因此对酶的作用机理研究以及DNA的检测显得尤为重要。荧光共振能量转移分析方法具有仪器简单、灵敏度高、操作简便等优点,广泛地应用于生物大分子的研究。本文第二章采用荧光素和阳离子共轭聚合物PFP为能量供受体对DNA聚合酶的作用机理进行了研究。荧光素标记的dGTP,在DNA聚合酶作用下与DNA结合,生成E-DNA-dGTP三元复合物,加入阳离子共轭聚合物后,共轭聚合物与DNA强烈作用,拉近了荧光素与PFP的距离,从而能发生荧光共振能量转移。通过检测DNA聚合酶与不同的DNA作用后的荧光共振能量转移情况,我们发现Klenow I DNA聚合酶与双链DNA作用,而Taq DNA聚合酶与引物—模板链的缺口处作用。本文第三章采用金纳米粒子和阳离子共轭聚合物PFP为能量供受体对进行DNA单碱基突变检测。首先在金纳米粒子表面包裹壳聚糖,GMP通过5’磷酸根与固定在金纳米粒子上的壳聚糖上的-NH2形成氨基磷酸酯键标记在金纳米粒子表面,在Klenow I DNA聚合酶作用下,碱基G与突变位点处的碱基C互补配对形成氢键,使金纳米粒子与DNA结合在一起,加入PFP后,PFP与DNA静电结合拉近金纳米粒子与PFP的距离,产生荧光共振能量转移,金纳米粒子猝灭PFP的荧光,从而实现了对单碱基突变的检测。该方法不需要荧光标记,且金纳米粒子修饰简单,建立了一种简便快速且价格低廉的DNA突变的检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 DNA聚合酶概述
• 1.2 纳米粒子在DNA分析中的应用
• 1.2.1 纳米粒子概述
• 1.2.2 纳米粒子在DNA分析中的应用
• 1.3 荧光共振能量转移原理及其在分析中的应用
• 1.3.1 荧光共振能量转移原理
• 1.3.2 荧光共振能量转移探针概述
• 1.3.3 荧光共振能量转移在生化分析中的应用
• 第2章 利用PFP荧光共振能量转移研究DNA聚合酶作用机理
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器和试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 Klenow Ⅰ DNA聚合酶与DNA作用光谱图
• 2.3.2 Taq DNA聚合酶与DNA作用光谱图
• 2.4 结论
• 第3章 利用PFP荧光共振能量转移检测DNA单碱基突变
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器和试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 壳聚糖对金纳米粒子吸光度的影响
• 3.3.2 金纳米粒子修饰前后对PFP荧光的影响
• 3.3.3 单碱基突变检测
• 3.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间取得的科研成果