N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其对伴放线放线杆菌生物膜作用的研究

论文摘要

生物膜（biofilm）是由细菌和其分泌的胞外基质在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构。一旦形成生物膜,细菌将具有极强的抗生素耐药性（比浮游细菌高100～1000倍）和逃避机体免疫系统攻击的能力。生物膜无处不在,在很多方面给人类生活带来严重的影响。根据美国NIH的调查公告,80%以上的细菌性感染与生物膜有关。由于传统的抗菌药物对细菌生物膜几乎没有作用,因此,如何防治细菌生物膜已成为人类面临的巨大挑战。牙菌斑生物膜是牙周病的始动因素,在牙菌斑生物膜的刺激下,牙周组织细胞分泌的细胞因子在牙槽骨吸收及牙周软组织破坏的过程中发挥着重要作用。然而,目前绝大多数研究集中在浮游细菌对牙周组织细胞毒性的研究,而关于细菌生物膜与牙周病的研究极少。胞外多糖是细菌生物膜的主要成分,它决定了生物膜的结构和功能。最新研究表明,伴放线放线杆菌是侵袭性牙周炎的主要致病菌,它产生的β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺是其生物膜的主要成份,在生物膜形成和致病性方面发挥着重要作用。因此,本论文旨在从海洋微生物中筛选降解β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺的多糖水解酶,并研究其抗牙菌斑细菌生物膜的作用。以β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺为唯一碳源的选择性培养基,从黄海海泥样品中筛选到一株高产N-乙酰葡萄糖苷酶的菌株。经16S rRNA技术鉴定,该菌株被鉴定为假交替单胞菌属,命名为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）QY403。利用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析技术,从菌株QY403的发酵液上清中分离纯化到一种N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1。该酶的分子量为40.2 kD;酶反应的最适pH为6.0,pH稳定范围为5.0～7.2;最适反应温度为40℃,酶的活性在0～40℃之间基本稳定;Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Fe2+、Fe3+、EDTA对于酶的活性有促进作用,而Cu2+、Ni2+对于酶的活性有抑制作用,SDS可以使酶完全失去活性。酶的底物专一性分析结果表明该酶能特异性降解β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺。在上述研究的基础上,本文进一步研究了N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1的抗A.a生物膜作用,并且从细胞因子产生的角度观察了NagY1对A.a致病性的影响。首先,利用A.a的体外生物膜模型,评价了不同浓度的NagY1对A.a生物膜形成的抑制作用和对已形成生物膜的清除作用。结果显示,NagY1对A.a生物膜形成具有显著的抑制作用（＞50%）,并且对已形成生物膜的清除率为74.5%（P＜0.05）。其次,研究了A.a生物膜刺激对人牙周韧带细胞产生细胞因子RANKL、IL-6、IL-1β、IL-8、IFN-γ的影响以及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶降解A.a生物膜对牙周韧带细胞产生细胞因子的影响。将A.a生物膜与原代培养的人牙周韧带细胞共培养0-9h,用实时荧光定量PCR技术检测人牙周韧带细胞的细胞因子mRNA的表达量,分别与浮游A.a刺激组以及空白对照组进行比较分析。实验结果显示,A.a生物膜和浮游菌刺激均可以提高人牙周韧带细胞的IL-1β、IL-8、IFN-γmRNA表达量;A.a生物膜比A.a浮游菌具有更强地刺激人牙周韧带细胞产生细胞因子RANKL、IL-6、IL-1β、IL-8、IFN-γmRNA的作用（P＜0.05）。N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1降解A.a生物膜,使A.a生物膜刺激细胞人牙周韧带细胞产生细胞因子mRNA表达量较明显降低。综上所述,本论文筛选得到一株高产N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的海洋交替假单胞菌,并从其发酵上清液中成功地分离纯化了一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1;NagY1可以有效地抑制牙周病的常见致病菌A.a的生物膜形成和清除其已形成的生物膜;并且NagY1能显著地降低A.a生物膜引起的人牙周韧带细胞细胞因子mRNA表达量。本研究结果将为NagY1的临床应用提供理论基础,为牙周病等细菌生物膜相关疾病的防治开辟新途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 牙周病
• 1.1.1 牙周病的危害
• 1.1.1.1 牙周病的临床症状
• 1.1.1.2 牙周病与全身系统性疾病的关系
• 1.1.1.2.1 牙周病与心血管系统疾病
• 1.1.1.2.2 牙周病与糖尿病
• 1.1.1.2.3 牙周病与低出生体重儿
• 1.1.1.2.4 牙周病与消化道疾病
• 1.1.2 牙菌斑生物膜是牙周病的始动因素
• 1.1.2.1 细菌生物膜
• 1.1.2.1.1 细菌生物膜的特性
• 1.1.2.1.2 生物膜的发育过程
• 1.1.2.1.3 细菌生物膜感染的机制
• 1.1.2.2 A.a生物膜与牙周病
• 1.1.2.2.1 A.a生物膜的特征
• 1.1.2.2.2 A.a生物膜的形成
• 1.1.2.2.2.1 菌毛
• 1.1.2.2.2.2 多聚β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺
• 1.1.2.2.3 A.a产生的毒力因子
• 1.1.2.2.4 与牙周组织免疫反应有关细胞因子
• 1.2 多聚β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶
• 1.2.1 多聚β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺（poly β-1,6-GlcNAc,PGA）
• 1.2.1.1 多聚β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺的来源
• 1.2.1.2 PGA的构成
• 1.2.2 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶——DspB
• 1.2.2.1 DspB的底物特异性
• 1.2.2.2 DspB的结构功能分析
• 1.2.2.3 DspB抗生物膜的研究
• 2.N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1产生菌假交替单胞菌QY403的筛选与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种及培养基
• 2.1.2 产酶菌株的筛选
• 2.1.2.1 菌株的分离
• 2.1.2.2 发酵条件
• 2.1.3 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1活性测定
• 2.1.4 产酶菌株的鉴定
• 2.1.4.1 基因组DNA的提取
• 2.1.4.2 16S rRNA基因的克隆与分子系统学测定
• 2.1.4.3 数据分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 菌株筛选结果
• 2.2.2 16S rRNA基因序列分析和分子系统学鉴定
• 2.3 小结
• 3 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1的分离纯化与性质分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂和仪器
• 3.1.1.1 仪器与设备
• 3.1.1.2 试剂
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 细菌裂解
• 3.1.2.2 硫酸铵沉淀粗分离
• 3.1.2.3 离子交换层析
• 3.1.2.4 凝胶过滤层析
• 3.1.3 实验所用检测方法
• 3.1.3.1 蛋白质浓度测定方法
• 3.1.3.2 SDS-PAG
• 3.1.3.3 酶活检测方法
• 3.1.4 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1的生化性质检测
• 3.1.4.1 温度对酶活性的影响
• 3.1.4.2 pH对酶活性的影响
• 3.1.4.3 EDTA、金属离子对酶活性的影响
• 3.1.4.4 底物特异性实验
• 3.1.4.4.1 β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺及β-1,4-N-乙酰葡聚糖胺的制备
• 3.1.4.4.2 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1底物特异性
• 3.2 结果
• 3.2.1 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1分离纯化
• 3.2.1.1 离子交换层析
• 3.2.1.2 凝胶过滤层析
• 3.2.1.3 SDS-PAGE电泳
• 3.2.2 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1的性质分析
• 3.2.2.1 温度对酶活性的影响
• 3.2.2.2 pH对酶活性的影响
• 3.2.2.3 EDTA、金属离子对酶活性的影响
• 3.2.2.4 底物特异性试验
• 3.3 小结
• 4 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1抗伴放线放线杆菌生物膜作用
• 4.1.材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 菌株
• 4.1.1.2 试剂
• 4.1.1.3 仪器及设备
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 96孔板伴放线放线杆菌生物膜的构建
• 4.1.2.2 盖玻片上A.a生物膜模型的构建
• 4.1.2.3 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对伴放线放线杆菌已形成生物膜的降解作用
• 4.1.2.4 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对伴放线放线杆菌生物膜形成的影响
• 4.1.2.5 统计学分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 96孔板上伴放线放线杆菌生物膜的建立
• 4.2.2 盖玻片上伴放线放线杆菌生物膜的建立
• 4.2.3 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对伴放线放线杆菌生物膜的降解作用
• 4.2.4 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对伴放线放线杆菌生物膜形成的影响
• 4.3 讨论
• 5 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对A.a生物膜致病性的影响
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 仪器及设备
• 5.1.4 A.a的培养
• 5.1.5 人牙周韧带细胞的原代培养
• 5.1.6 浮游及生物膜状态A.a与牙周韧带细胞共培养
• 5.1.7 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对伴放线放线杆菌生物膜刺激牙周韧带细胞产生细胞因子mRNA的影响
• 5.1.8 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对牙周韧带细胞状态的影响
• 5.1.9 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对牙周韧带细胞细胞因子mRNA表达的影响
• 5.1.10 细胞总RNA提取
• 5.1.11 RNA反转录
• 5.1.12 实时荧光定量PCR法检测人牙周韧带细胞产生的细胞因子mRNA的量
• 5.1.12.1 PCR反应体系
• 5.1.12.2 PCR反应条件
• 5.1.12.3 统计分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 浮游及生物膜状态A.a培养及细菌数量校正
• 5.2.2 人牙周韧带细胞的培养及鉴定
• 5.2.3 总RNA的提取
• 5.2.4 RNA反转录
• 5.2.5 实时荧光定量PCR分析
• 5.2.5.1 实时荧光定量扩增曲线图
• 5.2.5.2 人牙周韧带细胞分别与A.a生物膜和浮游菌共培养产生的细胞因子mRNA的表达量
• 5.2.5.3 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对伴放线放线杆菌生物膜刺激牙周韧带细胞产生细胞因子mRNA的影响
• 5.2.5.4 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对人牙周韧带细胞增殖功能的影响
• 5.2.5.5 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对人牙周韧带细胞黏附功能的影响
• 5.2.5.6 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对牙周韧带细胞细胞因子mRNA表达的影响
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果