蛋白酪氨酸激酶及雷洛昔芬对心肌离子通道调控作用的研究

论文摘要

第一部分蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶对心肌钠通道调控作用的研究蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTKs）是参与细胞肥大、增殖、迁移、分化、凋亡等基本生命过程的重要信号分子，可以特异性地磷酸化蛋白肽链中的酪氨酸残基，从而调控蛋白质（包括离子通道蛋白）的功能。蛋白磷酸酶（protein phosphatase）是指具有催化已磷酸化的蛋白分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统，如同“阴”与“阳”说法，形成一种平衡，如蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs），在蛋白磷酸化及信号转导中起重要作用。近来诸多研究表明酪氨酸残基上的蛋白磷酸化可调控离子通道，包括Ca2+通道和某些种类的K+通道，还有容量激活的Cl-通道。关于PTKs如何调控心脏INa的研究很少见，INa是否受PTKs和PTPs相互作用的影响目前也尚不清楚。本研究以豚鼠心室肌细胞为对象，应用多种PTKs和PTPs特异性抑制剂，采取全细胞膜片钳技术，免疫沉淀和免疫印迹法等研究PTKs和PTPs能否及如何调控INa，为细胞内信号转导物质对离子通道的调控提供进一步的认识。一、表皮生长因子受体（EGFR）家族PTK抑制剂B56对豚鼠心室肌细胞钠电流的影响方法：采用酶消化法分离豚鼠单个心室肌细胞，以全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞钠电流(INa)，研究B56对豚鼠心室肌INa的作用。结果：1～30μM B56浓度依赖性地减少INa，EC50为7.6μM。5μM B56使电压依赖性的INa明显减小，峰值电位-35mV时，INa由-23.3±2.0pA／pF减至-12.4±0.9pA／pF（n=10，P＜0.01），此作用经药物洗脱后可部分逆转，INa恢复至-20.3±1.9pA／pF。5μM B56不影响INa稳态激活曲线，但使INa稳态失活曲线向负电位方向移动，用药前后半失活电压(V1／2)分别为-89.9±1.5和-97.7±1.0mV（n=7，P＜0.01），V1／2变化7.8mV。药物被冲洗后V1／2恢复至-94.5±1.6mV。5μM B56使INa失活后恢复过程明显减慢，其恢复曲线给药前可用单指数式拟合，时间常数为5.3±0.1ms；而给药后恢复曲线只能以双指数式拟合，时间常数分别为2.8±0.4 and 219.3±71ms（n=7）。药物经洗脱后此作用可被逆转，时间常数恢复至6.1±0.2ms（P=NS vs control）。对给药前后INa激活和失活动力学的拟合分析发现，5μM B56使INa在膜电位-50～-10mV时，失活过程时间常数（τh）减小，而基本不影响激活过程时间常数（τm）。-35mV下τh由2.1±0.1ms减至1.8±0.1ms（n=7，P＜0.01）。二、血小板衍生生长因子受体（plateletderived growth factor receptot，PDGFR）家族PTK抑制剂Tyrphostin AG1295和非受体型Src家族PTK抑制剂PP2对豚鼠心室肌细胞钠电流的作用方法：采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞INa，研究Tyrphostin AG1295和PP2对豚鼠心室肌INa的作用。结果：高浓度Tyrphostin AG1295（100μM）及PP2（5μM）对INa没有明显抑制作用，抑制率分别为1.5±2.2％（n=4，P=NS）和1.7±0.9％（n=5，P=NS）。三、PTP抑制剂orthovanadate(VO43-)对豚鼠心室肌钠电流的影响方法：采用全细胞膜片钳技术记录INa，研究VO43-对豚鼠心室肌INa的作用。结果：0.3，1，3，5mM VO43-浓度依赖性地增加INa，EC50为1.8mM。1mMVO43-使电压依赖性的INa明显增大，峰值电位-35mV时，INa由-21.4±3.3pA／pF增至-26.2±3.7pA／pF（n=10，P＜0.01），药物洗脱后恢复至-20.1±3.0 pA／pF。1mM VO43-可加速INa激活和失活过程，在膜电位-50～-10mV时1mM VO43-使τm和τh均减小，-35mV下τm由0.53±0.04ms减至0.41±0.03ms，τh由2.09±0.16ms减至1.65±0.12ms（n=7，P＜0.01）。未发现1mM VO43-对INa的稳态激活曲线和稳态失活曲线及失活后恢复曲线有明显影响。四、VO43-对B56作用的影响方法：采用全细胞膜片钳技术记录INa，研究VO43-预处理下B56对豚鼠心室肌INa的作用，以观察VO43-对B56作用的影响。结果：B56对INa的抑制作用可被VO43-对抗。单用5μM B56时，INa抑制率为33.4±2.2％（n=10，P＜0.01 vs control），而合用1mM VO43-和5μM B56时INa抑制率仅为8.8±2.3％（n=6，P＜0.01 vs B56 alone）。VO43-的预处理还可以对抗B56引起的INa稳态失活曲线向负电位方向移动的作用，在1mM VO43-的存在下，5μM B56对V1／2并无明显改变（-86.4±1.2 vs -89.7±1.0 mV，n=6，P=NS）。VO43-还影响B56对，INa失活后恢复的作用。合并用药虽仍使失活后恢复曲线时间常数由4.1±0.4ms延长至5.2±0.15 ms(n=6，P＜0.05 vs VO43- alone)，但与单用5μM B56时失活后恢复曲线的显著改变明显不同。五、表皮生长因子（EGF）对豚鼠心室肌钠电流的影响方法：采用全细胞膜片钳技术记录INa，研究EGF对豚鼠心室肌INa的作用。结果：100ng／ml EGF能明显增加INa，且同时加速INa的激活和失活过程，作用与VO43-的类似。100ng／ml EGF对INa的稳态激活曲线和稳态失活曲线及失活后恢复曲线没有明显影响。六、钠通道酪氨酸磷酸化水平的变化方法：采用免疫沉淀和免疫印迹法测定钠通道酪氨酸磷酸化水平。结果：1mM VO43-使钠通道酪氨酸磷酸化水平提高，100ng／ml EGF作用和VO43-类似；30μM B56则降低了钠通道酪氨酸磷酸化水平，其作用可被VO43-所逆转。结论1．EGFR家族PTK抑制剂B56显著性抑制INa，提示EGFR家族PTK可能参与INa的调控。2．PDGFR家族PTK抑制剂Tyrphostin AG1295和非受体型Src家族PTK抑制剂PP2对INa无明显作用，提示这两个家族PTK可能不参与INa的调控。3．PTP抑制剂VO43-显著性增加INa，提示PTP可能参与INa的调控。4．VO43-可影响B56对INa的作用，提示INa可能受PTKs和PTPs相互影响的调控。5．EGF可显著性增加INa，提示EGF可能通过EGFR调控INa。6．钠通道酪氨酸磷酸化水平发生相应改变，提示PTPs和EGFR激酶共同影响钠通道蛋白磷酸化。本研究为心脏钠电流受细胞内信号转导物质的调控提供了新的认识：INa受PTKs和PTPs相互作用的影响，PTPs负向调控INa，而EGFR家族PTK正向调控INa，提示心脏电兴奋性可能被PTKs和PTPs的平衡所调控。第二部分选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬对心肌离子通道的影响雷洛昔芬（Raloxifene，RLX）是第二代选择性雌激素受体调节剂，目前临床上主要用于治疗绝经后妇女骨质疏松症。由于其有良好的组织选择性，对生殖系统没有明显的刺激作用，已引起人们的广泛关注。已证实雷洛昔芬可通过雌激素受体介导或非雌激素受体依赖机制影响血管壁功能及血脂调节而发挥心血管保护作用。近来有研究表明雷洛昔芬可抑制豚鼠心室肌细胞L型钙电流并缩短动作电位时程。但雷洛昔芬是否影响心脏其它离子通道目前尚未见报导。本工作研究雷洛昔芬对心脏几种重要的离子通道电流的作用，为进一步探讨雷洛昔芬对心脏的直接作用提供新的实验依据和理论基础。一、雷洛昔芬对人心房瞬时外向钾电流和超快激活的延迟整流钾电流的影响方法：采用酶消化法分离人心房肌细胞，以全细胞膜片钳技术记录人心房瞬时外向钾电流(Ito1)和超快激活的延迟整流钾电流(IKur)，研究RLX对Ito1和IKur的作用。结果：0.1～10μM RLX浓度依赖性地减少Ito1，EC50为0.9μM。RLX在0.3，1，3 and 10μM各浓度下对0mV至+60mV记录到的Ito1均有抑制作用（n=6，P＜0.05 or P＜0.01 vs control），但此抑制作用没有明显的电压依赖性。1μM RLX使电压依赖性的Ito1明显减小，+50mV时，Ito1由10.9±1.0pA／pF减至6.1±0.6pA／pF（n=8，P＜0.01），此作用经药物洗脱后可部分逆转，Ito1恢复至8.2±0.8pA／pF。1μM RLX使Ito1失活后恢复过程明显减慢，且作用是可逆的。给药前恢复时间常数τ为66.4±9.5ms，1μM RLX使τ延长至105.0±12.4ms（n=6，P＜0.05），药物洗脱后τ恢复至69.3±7.5ms。对给药前后Ito1激活和失活动力学的拟合分析发现，1μM RLX加快Ito1失活，在0mV至+60mV下，RLX使τ明显减少（n=6，P＜0.01 vs control）；反映电流激活动力学的参数（达峰时间）也受RLX的影响。在0mV至+60mV下，1μM RLX使Ito1达峰时间明显缩短（n=6，P＜0.01 vs control）。RLX不影响Ito1的稳态激活和稳态失活曲线。0.3～10μM RLX浓度依赖性地减少IKur，EC50为0.7μM，且1，3，and 10μM浓度下的抑制作用在+10mV至+60mV间呈现明显的电压依赖性。雌激素受体拮抗剂ICI 182，780的预处理不影响RLX对Ito1和Ikur的抑制作用。二、17β-雌二醇对人心房瞬时外向钾电流和超快激活的延迟整流钾电流的影响方法：采用酶消化法分离人心房肌细胞，以全细胞膜片钳技术记录人心房瞬时外向钾电流(Ito1)和超快激活的延迟整流钾电流(IKur)，研究17β-雌二醇对Ito1和IKur的作用。结果：17β-雌二醇对Ito1呈浓度依赖性的抑制作用，此作用为可逆性的。EC50为10.3μM，b为1.1，最大效能为57.6％。17β-雌二醇不影响激活动力学参数达峰时间，但加快Ito1失活，+50mV下，失活时间常数在给药前后分别为53.1±7.4ms和41.7±7.5ms（n=5，P＜0.05）。17β-雌二醇对Ito1的稳态激活曲线和稳态失活曲线均无明显影响，给药前激活曲线和失活曲线V1／2分别为13.2±1.9mV和-24.5±1.2mV，使用10μM 17β-雌二醇后，V1／2分别为14.8±2.0mV（n=5，P=NS）和-25.2±1.1mV（n=5，P=NS）；17β-雌二醇也不影响失活后恢复过程，恢复时间常数变化不大（69.8±12.3ms vs 71.2±10.5ms，n=5，P=NS）。1～30μM 17β-雌二醇对IKur没有明显作用。雌激素受体拮抗剂ICI 182，780的预处理不影响17β-雌二醇对Ito1的抑制作用。三、雷洛昔芬对克隆的人心脏延迟整流钾电流的影响方法：采用细胞培养、基因转染和全细胞膜片钳技术，研究RLX表达在人胚胎肾细胞上的人心脏HERG电流(IHERG)和hKCNQ1／hKCNE1通道电流(IKs)的影响。结果：0.1～10μM RLX浓度依赖性地减小IHERG，其对IHERG，step和IHERG，tail的抑制率略有差别。+30mV下，RLX抑制IHERG，step的EC50为1.1μM，RLX抑制IHERG，tail的EC50为2.3μM。IHERG，step和IHERG，tail在-20～+60mV下均被RLX所抑制（n=6，P＜0.01 vs control）。RLX对IHERG的抑制作用无使用依赖性，也不影响IHERG时间依赖性的激活过程（时间常数于给药前后分别为238.9±28.9ms和236.4±39.5ms，n=5，P=NS），对IHERG稳态失活曲线没有明显移动(使用1μM RLX前后V1／2和S分别为-59.1±2.2mV、-17.2±0.5mV和-62.0±3.1mV、-18.4±1.1mV，n=6，P=NS)。1～30μM RLX对IKs呈浓度依赖性的抑制作用，EC50为5.1μM；IKs在-20～+60mV下均被RLX所抑制（n=6，P＜0.01 vs control）。3μMRLX不影响稳态激活曲线，V1／2和S在给药前后分别为25.2±1.2mV、15.7±1.1mV和26.9±1.8mV、14.9±0.9mV（n=6，P=NS）。结论1．雷洛昔芬可明显抑制Ito1和Ikur，且作用不受雌激素受体拮抗剂ICI 182，780的影响。2．17β-雌二醇对Ito1有明显抑制作用，但作用较雷洛昔芬的弱，其作用也不受雌激素受体拮抗剂ICI 182，780的影响。17β-雌二醇对Ikur作用不明显。3．雷洛昔芬显著性抑制IHERG和IKs。本研究结果证实雷洛昔芬对心脏几种参与心肌细胞动作电位复极化的重要离子通道均有抑制作用，为进一步探讨雷洛昔芬对心脏的直接作用及其对心血管保护作用提供新的实验依据和理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶对豚鼠心肌钠通道调控作用的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬对心肌离子通道的影响
• §1 雷洛昔芬对人心房肌细胞瞬时外向钾电流和超快激活延迟整流钾电流的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• §2 雷洛昔芬对克隆的人心脏延迟整流钾电流的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 第一部分:蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶对心肌钠通道调控作用的研究
• 第二部分:选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬对心肌离子通道的影响
• 本课题有以下几个创新之处:
• 综述
• 博士期间发表及待发表论文
• 致谢