Juxtanodin特异性抗体的制备与结构分析

论文摘要

目的:对Juxtanodin（JN）的氨基酸序列特点及分子结构进行分析,制备并纯化JN的多克隆抗体,观察JN对少突胶质细胞形态的影响,为进一步研究JN分子的功能,尤其是对中枢神经系统髓鞘形成的作用奠定基础。方法:PCR扩增JN氨基端170个氨基酸（JN170）的核苷酸序列,构建pET41a（+）-JN170原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达GST-JN170融合蛋白,纯化重组融合蛋白,分别用传统法和快速法免疫家兔制备JN抗血清,并对免疫后的抗血清进行亲和纯化,western blot鉴定JN抗血清和纯化后抗体的反应特异性,应用免疫组织化学、细胞免疫荧光和组织免疫荧光等方法确定JN在细胞中的定位以及对细胞形态的影响。利用生物信息学方法,对JN的氨基酸序列及结构特点进行分析,初步验证JN的蛋白酶活性。结果:测序证实原核表达载体pET41a（+）-JN170和真核表达载体pcDNA3.1myc-his（-）-JN构建成功;SDS-PAGE电泳分析证明获得了可溶性形式表达的GST-JN170融合蛋白;应用纯化的重组蛋白免疫家兔,获得了JN170抗血清,亲和纯化后得到纯化的JN170抗体。Western blot证明传统法和快速法都能够产生具有特异性的JN170抗血清,但快速法的特异性更高。细胞免疫荧光发现JN分子在少突胶质细胞中主要分布在胞浆和细胞突起中。生物信息学分析发现JN的C端含有一个Actin结合结构域,属于ERM蛋白家族的保守结构序列,不同种属JN的N端氨基酸序列存在差异。还原与非还原电泳结合western blot证明JN分子并不以二聚体形式存在,但可能存在其他形式的修饰。JN170可能具有蛋白酶活性。结论:成功构建了JN分子的原核和真核表达载体,获得了可溶性的GST-JN170重组融合蛋白。通过快速法和传统法分别获得了特异性的JN170抗血清和亲和纯化抗体,并发现JN分子在细胞中主要分布在胞浆和细胞突起中,提示JN可能与细胞运动和细胞形态的改变密切相关。对其结构的分析发现JN的C端含有一个actin结合结构域,它属于ERM蛋白家族的保守结构序列,不同种属的N端结构序列存在差异,而且可能具有蛋白酶活性。本研究为进一步探讨JN分子在少突胶质细胞迁移及中枢神经系统髓鞘形成中的作用奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 第一部分 Juxtanodin 特异性抗体的制备及鉴定
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要材料和试剂
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 大鼠脑组织总RNA 的提取
• 2.2 RNA 逆转录
• 2.3 原核表达载体pET41a（+）-JN170 的构建
• 2.4 真核表达载体pcDNA3.1myc-his（-）-JN 的构建
• 2.5 JN170 融合蛋白的诱导表达和纯化
• 2.6 JN170 抗血清的制备和纯化
• 2.7 ELISA
• 2.8 蛋白免疫印记（western blot）
• 2.9 C6 胶质瘤细胞的培养和转染
• 2.10 间接免疫荧光和免疫组化
• 3 结果
• 3.1 原核表达载体pET41a（+）-JN170 的构建鉴定
• 3.2 真核表达载体pcDNA3.1myc-his（-）-JN 的构建鉴定
• 3.3 JN170 融合蛋白的诱导表达和纯化
• 3.4 ELISA 检测JN170 抗血清
• 3.5 蛋白免疫印记（western blot）鉴定JN170 抗血清及纯化后抗体-
• 3.6 细胞免疫荧光鉴定JN170 抗体
• 3.7 组织免疫荧光鉴定JN170 抗体
• 3.8 免疫组织化学鉴定JN170 抗体
• 4 讨论
• 第二部分 Juxtanodin 的结构分析
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要材料和试剂
• 2 方法
• 2.1 JN 氨基酸序列的生物信息学分析
• 2.2 还原和非还原SDS-PAGE 电泳和western blot
• 2.3 SDS-PAGE 电泳分析GST-JN170 的蛋白酶活性
• 3 结果
• 3.1 JN 氨基酸序列的生物信息学分析
• 3.2 JN 二聚体形式的验证
• 3.3 GST-JN170 的蛋白酶活性分析
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢