论文摘要
纺锤体检测点控制染色体分离的忠诚性。DNA和纺锤体损伤均能激活纺锤体检测点。人胃癌细胞纺锤体检测点普遍存在缺陷,我们前期研究表明纺锤体检测点的缺陷能增强胃癌细胞对“纺锤体抑制剂和DNA损伤剂”的耐受性。Mad2在纺锤体检测点介导的细胞死亡信号通路中具有重要作用。我们前期发现Mad2的选择性剪切体Mad2β仅在胃癌耐药细胞系中表达,Mad2β的表达能够抑制正常Mad2蛋白的表达,并通过减轻有丝分裂阻滞和凋亡促进胃癌细胞对DNA损伤剂和纺锤体抑制剂的耐受性,Mad2及其选择性剪切体Mad2β参与了胃癌细胞纺锤体检测点和程序化死亡之间的交联信号通路。本研究旨在进一步探究Mad2促进胃癌多药耐药的作用,探讨Mad2和Survivin等参与胃癌耐药的分子机制,深入研究细胞周期检测点关键蛋白Mad2、Survivin和ATM等在胃癌化疗中所起的作用及调控机制,最终为深入理解化疗药物激活细胞周期检测点诱发凋亡的分子机制,阐明胃癌发生、发展和预防治疗提供有益的线索。【目的】1.研究Mad2和Survivin在胃癌细胞系和组织中的表达情况及其与临床相关参数的关系。2.明确纺锤体检测点缺陷的胃癌细胞的生物学行为。3.进一步探讨Mad2通过Survivin调控胃癌细胞化疗敏感性的分子机制。4.初步探讨ATM基因表达状况对相关分子和细胞凋亡的影响机制。【方法】1.应用RT-PCR、Western blot和免疫组化等方法检测人正常组织和胃癌组织细胞中Mad2及Survivin的表达情况,并统计分析其临床病理意义。2.构建Mad2小干扰RNA的真核表达载体,转染Mad2表达正常的SGC7901细胞,并用G418筛选,获得稳定克隆。3.对稳定转染的细胞进行半定量RT-PCR、Western blot检测,观察Mad2-siRNA对胃癌细胞Mad2的抑制效果。4.通过MTT、克隆形成实验和细胞染色等实验测定Mad2小干扰RNA转染SGC7901细胞后对化疗药物的敏感性和凋亡率,通过细胞损伤刮擦实验、Transwell小室和裸鼠体内成瘤实验观察Mad2沉默后胃癌细胞的生物学行为。5.Western blot方法分析Mad2下调对凋亡相关分子（Fas L、Bcl-2、细胞色素C、活性caspase 9及Survivin）的影响。6.采用免疫共沉淀和免疫印迹检测Mad2与Survivin的结合能力。7.流式细胞仪分析DNA损伤剂CDDP和纺锤体抑制剂VCR作用后,细胞周期分布的变化。8.通过体内外药敏试验测定Mad2小干扰RNA转染SGC7901细胞后对化疗药物的敏感性。9.流式细胞仪检测ADR处理后细胞内蓄积和潴留ADR的平均荧光强度,并计算出ADR的泵出率。10.Annexin V/PI染色及双苯并咪唑染料活细胞吸收分析法检测细胞经VCR、CDDP诱导后的凋亡水平。11.Westernblot检测BGC823和MKN28细胞中G2期检测点蛋白ATM、磷酸化chk1,磷酸化chk2,CDC25C在药物作用前后的表达。DNA Ladder和Hochest33258/PI染色测定细胞的凋亡。【结果】1.六株胃癌细胞系（MKN28,MKN45,AGS,KATOⅢ,MGC803,SGC7901）均表达不同水平的Mad2 mRNA和Mad2蛋白。102例胃腺癌患者中,70.6%的胃癌组织中Mad2高表达,与正常黏膜相比差异有显著性（p＜0.05）,其表达与不同分化的肿瘤有显著差异（p＜0.05）,Mad2表达率与患者性别、年龄及术后生存期无统计学差异,但Mad2表达与淋巴结转移呈负相关。2.在80例胃腺癌组织研究病例中,32例Survivin阳性表达,阳性率为40%,癌旁正常胃组织均无Survivin的表达。在高、中、低分化胃癌中,Survivin表达阳性率与肿瘤分化程度不相关（p＞0.05）,在淋巴结转移病例中Survivin蛋白呈高表达,研究还发现Survivin蛋白表达与患者生存期具有统计学差异（p＜0.05）。3.成功将Mad2siRNA载体转染SGC7901细胞,G418筛选获得稳定表达的克隆,经mRNA和蛋白水平检测证实转染胃癌细胞系成功,且对细胞中Mad2的抑制效果显著。4.Mad2-siRNA转染后细胞对上述药物的IC50值增高,细胞侵袭性和增殖能力增高。5.细胞周期检测显示SGC7901和空载体组细胞与未用药时比较,G2/M期细胞比例明显增多,G1期比例减少。而Mad2表达下调的siMad2/SGC7901细胞在用药前后细胞周期无明显改变。6.通过体内外药敏试验证实,与空载体转染组比较,Mad2siRNA转染后的细胞对多种化疗药物的耐受性增强。7.流式细胞仪检测显示siMad2/SGC7901细胞能排出绝大部分的ADR,细胞内蓄积和潴留的ADR较对照组细胞明显减低,ADR泵出率明显增加。8.用流式细胞仪和荧光染色法检测发现抑制Mad2的表达能增强胃癌细胞对VCR和CDDP诱导的凋亡的抵抗。9.Western blot检测转染细胞凋亡相关分子发现,对照组细胞中Bcl-2的表达明显低于siMad2/SGC7901。Mad2蛋白下调可以通过抑制线粒体途径而减少由DNA损伤剂和纺锤体抑制剂诱导的胃癌细胞凋亡。10.Western blot检测发现在siMad2/SGC7901转染细胞系中,磷酸化的Survivin表达较对照组明显升高。免疫沉淀和免疫印迹检测显示Mad2蛋白可与Survivin结合形成复合物。11.Western blot检测发现MKN28细胞中ATM蛋白明显低于BGC823细胞,而且在DNA损伤剂CDDP（1.0μg/ml）作用前后无明显变化,MKN28细胞在CDDP作用后出现明显凋亡,说明MKN28存在着G2期检测点缺陷。【结论】1.Mad2蛋白表达阳性率随肿瘤分化程度的降低而降低;同时Mad2表达与淋巴结转移呈负相关。Survivin表达阳性率与肿瘤分化程度不相关（p＞0.05）,Survivin蛋白表达与患者淋巴结转移呈正相关,和患者生存期呈负相关（p＜0.05）。2.Mad2表达缺陷的SGC7901细胞,对DNA损伤及纺锤体损伤增加耐药性,其侵袭性和增殖能力亦提高。有丝分裂纺锤体检测点的缺陷能促进肿瘤细胞对多种化疗药物形成耐受性。3.Mad2蛋白可能通过与Survivin相互结合调控有丝分裂期Survivin的抗凋亡作用而参与纺锤体检测点介导的细胞凋亡信号通路。4.ATM缺陷可导致G2期检测点功能缺失,细胞对DNA损伤敏感,凋亡增加。