论文摘要
哺乳动物耳蜗Corti器具有非常精密的结构,是感知声音的器官,正常听力的维持需要一定数量的毛细胞参与,当某些因素如过度声刺激、使用耳毒性药物、年龄衰老等引起的内外毛细胞不可逆性的损伤,必将导致永久性感音神经性耳聋。传统观点认为,哺乳动物毛细胞不具备再生的能力,所以,迄今为止,有效治疗感音神经性耳聋仍是耳科临床医生的难题。近年来,随着对内耳感觉上皮发育分子机制研究的深入,发现Math1基因是毛细胞分化所必需的基因;很多研究表明Notch信号相关的靶基因家族,其中主要有Hes1、Hes5基因;在哺乳动物内耳感觉上皮的定向分化,特别在毛细胞的形成中起关键作用,并参与侧抑制的调控及基底膜嵌合体的形成。在体内外过表达math1基因或加入γ-分泌酶抑制剂,均能够使耳蜗产生新的毛细胞样细胞。但是单独应用时,在动物体内产生的毛细胞数往往非常有限,怎样才能使毛细胞数产生的更多呢?如果γ-分泌酶抑制剂和过表达math1基因两者联合应用是否会产生更多的毛细胞?目前还没有相关研究。本研究通过离体培养新生（P1）大鼠耳蜗基底膜为实验基础,观察离体培养的基底膜毛细胞生长发育与在体耳蜗P1、P7、P14毛细胞形态结构及排列方式的区别,并观察使用γ-分泌酶抑制剂DAPT和转染ad-math1-EGFP过表达外源性math1基因后,对毛细胞发育、分化等影响,运用多种形态学方法对不同条件下离体培养基底膜毛细胞的变化作初步研究,以便为在体实验提供参考。研究分以下两个部分。第一部分离体培养与在体Corti’s器毛细胞发育比较目的:观察比较离体培养的基底膜毛细胞与在体耳蜗毛细胞的生长发育规律。方法:将新生P0、P7、P14 SD大鼠消毒后,断头取出各阶段的耳蜗固定灌流;将部分P0在L15液里分离出带螺旋神经节的基底膜,修剪后,贴壁培养,分别培养7天、14天,采用扫描电镜观察离体培养后和P0、P7、P14在体动物耳蜗基底膜毛细胞形态结构变化。结果:扫描电镜下在体P0、P7、P14大鼠耳蜗毛细胞从出生至毛细胞基本发育成熟,绝大部分都是以1排内毛细胞和3排外毛细胞的方式排列的。毛细胞的形态结构及排列方式随着时间的改变逐渐发育成熟;P14耳蜗毛细胞各个部分已经完全发育成熟,柱细胞头板增宽,各细胞表面微绒毛减少,动纤毛从底圈至顶圈逐渐退化已经基本结束。离体培养7天时,基底膜毛细胞生长状况良好,以1排内毛细胞和3排外毛细胞排列,毛细胞静纤毛逐渐发育成熟;培养14天时,大部分只剩1排内毛细胞和1-2排外毛细胞,基底膜毛细胞形态很差,基本上发生融合、缺失,甚至皮板塌陷。结论:1、在P0-P14这个时间段,大鼠耳蜗Corti器由底圈到顶圈,内毛细胞、外毛细胞及支持细胞由不成熟到成熟的逐渐发育过程。2、体外培养7天的基底膜总体生长状态良好,内外毛细胞及支持细胞逐渐发育成熟;培养14天的基底膜生长状态差,不同类型的细胞结构均已破坏。第二部分DAPT与Mathl联合应用对离体培养Corti’s器毛细胞发育与再生的影响目的:研究将γ-分泌酶抑制剂（DAPT）和ad-Math1-EGFP两者联合应用,观察是否比单独应用DAPT或ad-Math1-EGFP更能促进哺乳动物内耳毛细胞的发育和分化。方法:取材和培养方法同第一部分,随机分为正常培养组、DAPT组、ad-math1-EGFP组、DAPT+ad-math1-EGFP组,按培养时间又分为4天、7天和9天组。其中DAPT为γ-分泌酶抑制剂,溶解于终浓度低于0.1%的DMSO,每日换液均加入DAPT; ad-math1-EGFP组基底膜转染ad-math1-EGFP 1天,之后每天换液;DM组为培养时即加入DAPT,在8h后转染ad-math1-EGFP 1天,之后换液同DAPT组。采用免疫组织化学染色、扫描电镜及半薄切片观察基底膜毛细胞数量和组织形态学变化。结果:免疫组织化学染色及扫描电镜:正常组顶圈呈1排内毛细胞,2-3排外毛细胞;中圈呈1排内毛细胞,3排外毛细胞,内外毛细胞排列规则,随着培养天数的增加数量无明显变化。DAPT组及DM组顶圈呈1排内毛细胞,4-8排外毛细胞;中圈呈1排内毛细胞,3-5排外毛细胞。Math1组顶圈呈1排内毛细胞,3-4排外毛细胞,中圈呈1排内毛细胞,3-5排外毛细胞,毛细胞排列规则。DM组顶圈呈1排内毛细胞,4-8排外毛细胞,中圈呈1排内毛细胞,3-5排外毛细胞,7天组和9天组在Math1组和DM组GER细胞处均可见少量异位的myosinVIIa阳性的细胞。而DAPT组和DM组随着培养天数延长两组的毛细胞数有增加趋势,可见列外内毛细胞,外毛细胞排列紧密不规则,皮板上静纤毛发生转位现象。半薄切片:正常组呈1排内毛细胞,3排外毛细胞;math1组呈1排内毛细胞,4排外毛细胞;而DAPT组和DM组均见1排内毛细胞,5排外毛细胞。结论:1、DAPT能够诱导基底膜顶圈产生大量额外的外毛细胞,可能导致毛细胞静纤毛方向发生改变;2、过表达math1可诱导中圈GER处产生少量异位的毛细胞样细胞;3、两者合用既能使顶圈产生大量额外的外毛细胞又能使中圈GER处产生少量异位的毛细胞样细胞,两者具有累加效应。
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