论文摘要
RACK1蛋白属于一类含有WD-40重复结构蛋白家族的亚家族。WD-40重复蛋白是一类大的蛋白质家族,结构高度保守,广泛分布于真核生物和原核生物中,目前已鉴定到140多种蛋白属于WD-40重复蛋白家族。这类蛋白在多种生物生命活动过程中扮演非常重要的角色,如细胞信号转导、蛋白转运、细胞骨架的组装和解聚、RNA的加工、染色质的修饰及转录、细胞分裂、胞浆移动、细胞凋亡、光信号转导、细胞运动、开花、花序的发育以及分生组织的形成等。每个WD重复结构域包含40-60个氨基酸,WD结构域的N端一般是由Gly-His（GH）二肽组成的11到24个氨基酸残基,它的C端含有Trp-Asp（WD）二肽。最初RACK1蛋白被确定为蛋白激酶C（PKC）的受体,现在认为RACK1蛋白作为支架蛋白在多个信号转导途径中起重要作用。已有研究结果表明,拟南芥AtRACK1参与了植物对渗透胁迫信号的响应过程,并且与植物忍耐渗透胁迫密切相关。以AtRACK1蛋白的氨基酸序列为模板对水稻基因组序列进行比对,我们找到两个与编码AtRACK1蛋白高度同源的基因。在蛋白质水平两者与AtRACK1蛋白的同一性和相似性分别达到70%和80%。推测水稻的RACK1（OsRACK1）可能与拟南芥RACK1（AtRACK1）具有相似的功能。本研究以粳稻日本晴为研究材料,首先通过RT-PCR技术及T-A克隆法克隆了编码RACK1蛋白（NP-916988）的基因OsRACK1,并构建了OsRACK1基因的过表达载体和RNAi表达载体,再通过农杆菌介导的植物转化方法导入水稻并筛选出OsRACK1基因过表达和RNAi OsRACK1基因片段抑制表达的转基因植株,并进一步深入研究了OsRACK1基因在盐胁迫响应中的功能。主要结果如下:1提取水稻总RNA,并对其完整性进行了检测。2 RT法反转录合成了完整的OsRACK1基因的cDNA第一链,并以此为模板,用PCR技术扩增了双链OsRACK1的基因。序列分析表明,OsRACK1基因的大小为1199bp,包含了基因完整的编码序列,且与已发表的基因全序列完全相同,同源性达100%。3构建了带有由35S启动子控制的GUS基因的水稻OsRACK1基因的过表达载体和RNAi表达载体,并通过农杆菌介导的植物转化方法将其导入粳稻日本晴基因组中。4通过GUS染色进行初步的检测,然后对阳性植株进行基因组DNA PCR法鉴定,再用Southern blot对目的基因的真实性和拷贝数进行检测,最后通过RQ-PCR对OsRACK1基因的表达量进行鉴定获得了转基因水稻植株。5应用RACK1过表达（OX-2）和抑制表达（R-2）的转基因植株T1代种子进行的萌发试验及相关生理生化指标分析结果表明,在盐胁迫条件下OX-2种子萌发要快于对照和R-2种子的萌发;OX-2种子的根长、根数及芽长同样高于对照和R-2的;而且前者的可溶性糖的含量也较高,但可溶性蛋白和ABA含量低于对照与R-2的。表明RACK1过表达促进了盐胁迫条件下的种子萌发。6对相关转基因幼苗在盐胁迫条件下的生理分析结果表明,与对照（非转基因水稻）相比,在同样程度的盐胁迫条件下,RACK1过表达幼苗的相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量、氧化酶的活性和ABA含量均低于对照和R-2幼苗,而MDA含量和电导率高于对照和R-2植株。由此推测OsRACK1蛋白对幼苗耐盐性具有负调节作用。7对OsRACK1基因在调节植株耐盐性生理与分子机理的进一步研究结果表明,OsRACK1过表达的转基因幼苗无论根还是叶的K/Na比均低于对照和OsRACK1表达受抑制的转基因幼苗,而OsRACK1表达受抑制的转基因幼苗根系对K的吸收和运输均大于对照和过表达转基因幼苗。在盐胁迫下,OsRACK1表达受抑制的转基因幼苗内源ABA的含量显著高于OsRACK1过表达的转基因幼苗和对照。与无盐胁迫处理相比,盐胁迫处理显著促进了DREB1和P5CS的表达,但各基因型间差异不明显。外源ABA处理显著促进了P5CS的表达,但对DREB1的表达无作用。RACK1基因的表达不受盐胁迫和外源ABA影响,在盐胁迫下转基因水稻内源ABA的含量与RACK1的表达量成负显著相关性。根据以上研究并结合前人的研究结果,推测OsRACK1对盐胁迫条件下种子萌发和幼苗生长的调节机制不同;OsRACK1对幼苗耐盐胁迫具有负调节作用,当OsRACK1基因表达受到抑制后,通过某种机制调节ABA合成,进而提高了水稻对盐胁迫的忍耐性。