杂合抗菌肽的设计改造、真核表达及性质研究

论文摘要

抗菌肽因其杀菌的高效性、广谱性和不易产生耐药性等特点受到广泛关注，在医药和农业等相关领域有广阔的应用前景。杂合抗菌肽是一类新型抗菌肽，它由来自两种或多种抗菌肽的部分肽链组成，具有高效、广谱、低毒、肽链较短等特点。人工设计杂合肽是研究的热点之一，即选择一种抗菌肽为蓝本，对某些氨基酸做删减替换或与另外一种抗菌肽的片段拼接。研究表明，一些经过的改造的抗菌肽具有与蓝本相似或更高的活性，毒酣作用降低，而且变短的肽链为降低合成成本也奠定了基础。为了解决抗菌肽直接提取纯化困难、化学合成法的成本较高、原核表达产物可能导致活性丧失并对宿主有害且难以纯化等问题，选择真核表达系统成为基因工程表达抗菌肽的理想选择。因此，探索并设计新肽，改善原有抗菌肽的活性，降低或消除他们的溶血性，高效表达目的小肽对解决目前抗菌肽存在的问题都有着重要的意义和实验价值。目前，源自不同蓝本的杂合抗菌肽研究颇多，从不同方面达到或接近了预期效果；其中David等做了CecropinA和Melittin不同片段的拼接，成功的筛选到了几种肽链变短而活性较强的杂合肽，CA（1-7）M（4-11）就是其中的一个；鉴于还未见CB（1-7）M（4-11）的报道，本实验开展了以下研究：1、杂合抗菌肽的设计及真核表达载体的构建。在杂合抗菌肽CA（1-7）M（4-11）的基础上，设计了新肽CB（1-7）M（4-11），即由Cecropin B成熟肽N端1-7位氨基酸与Melittin成熟肽N端4-11位氨基酸拼接而成，与CA（1-7）M（4-11）相比，肽链的第四位由缬氨酸取代亮氨酸，并对二者进行了生物信息学分析；参照毕赤巴斯德酵母（Pichia pastoris）的偏好密码子，改造并合成杂合抗菌肽CA（1-7）M（4-11）和CB（1-7）M（4-11）基因，利用SOE法克隆杂合抗菌肽基因，最后将正确的基因序列与pPICZa-A构建表达载体，并通过酶切验证和再次测序。2、杂合抗菌肽CA（1-7）M（4-11）和CB（1-7）M（4-11）的真核表达，电转化及表达条件优化。本章将pPICZa-A-CA（1-7）M（4-11）和pPICZa-A-CB（1-7）M（4-11）转化了巴德毕赤酵母Pichia pastoris X-33，成功获得了工程菌；经诱导表达和小肽SDS-PAGE分析，结果显示蛋白分子量约为2.0kD，与预计相符；优化了电转方案，在7μg质粒、2cm电转杯的情况下，宿主菌P. pastoris X-33 OD600=1.0、电压为2000V、复苏2h时能取得最佳效果；优化了表达条件，在OD600=6.0时转入BMMY、0.5％甲醇诱导、26℃培养、48h收获的条件下，两种杂合肽的表达量可达125μg/mL和128μg/mL；此外，工程菌也显示出很好的遗传稳定性。3、杂合抗菌肽CA（1-7）M（4-11）和CB（1-7）M（4-11）的活性、效价、稳定性、抗菌谱及溶血性测定。实验结果表明，对E.coli、P.aeruginosa、K.pneumoniae和B.subtilis而言，CA-M的活性高于CB-M；对S.aureus、Salmonelladerby而言，CB-M则稍高于CA-M；两者对B.thuringiensis的抗性差别不大；两种杂合肽都具有较高的热稳定性，在中性偏酸的环境中活性较高，碱性环境中受到抑制；碱性环境中随着pH值逐渐增大，CB-M的活性受抑制程度没有CA-M强烈；两种杂合肽在检测的浓度范围内没有表现出溶血性，CB-M也消除了Melittin本身较强的溶血性。对杂合抗菌肽的预测和实验结果分析表明，a－螺旋是抗菌肽活性的必要条件，较强的阳离子性和两亲性也有积极的影响；这些因素是共同作用的，某个方面与活性无线性关系。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 论文
• 第一章 杂合抗菌肽基因的设计、合成及真核表达载体构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 酶制剂和试剂盒
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 仪器
• 1.1.6 引物及测序
• 1.2 方法
• 1.2.1 杂合抗菌肽的序列设计
• 1.2.2 杂合抗菌肽的生物信息学分析
• 1.2.3 杂合抗菌肽的基因改造
• 1.2.4 杂合抗菌肽基因的克隆
• 1.2.5 杂合抗菌肽真核表达载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 生物信息学分析结果
• 2.1.1 杂合抗菌肽的基本性质分析
• 2.1.2 杂合抗菌肽的二级结构分析
• 2.1.3 杂合抗菌肽的静电荷分析
• 2.2 重叠PCR的电泳验证
• 2.3 T-A克隆的酶切验证及测序
• 2.4 真核表达载体的酶切验证及测序
• 3 讨论
• 3.1 杂合抗菌肽的生物信息学分析
• 3.2 杂合抗菌肽基因的改造
• 3.3 小片段的高效胶回收
• 3.4 表达系统的可行性讨论
• 3.5 小片段的高效连接
• 第二章 杂合抗菌肽的真核表达及条件优化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 酶制剂
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 仪器
• 1.1.6 引物及测序
• 1.2 方法
• 1.2.1 毕赤酵母的转化
• 1.2.2 电转化条件优化
• 1.2.3 重组杂合肽的表达
• 1.2.4 表达条件优化
• 1.2.5 质粒稳定性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 酵母重组子的PCR验证
• 2.2 酵母电转化优化
• 2.2.1 P.pastorisX-33生长曲线的测定
• 2.2.2 P.pastorisX-33死亡率的测定
• 2.2.3 电转条件优化
• 2.3 杂合抗菌肽的表达
• 2.3.1 小肽SDS-PAGE凝胶电泳分析
• 2.3.2 粗蛋白的浓度测定
• 2.4 杂合抗菌肽的表达条件的优化
• 2.4.1 重组酵母菌的生长动力学
• 2.4.2 诱导时间
• 2.4.3 诱导初始OD600值
• 2.4.4 诱导剂浓度
• 2.4.5 培养基pH
• 2.4.6 诱导温度
• 2.5 质粒稳定性测定
• 2.5.1 选择性平板实验
• 2.5.2 PCR实验
• 3 讨论
• 3.1 酵母DNA的快速分离
• 3.2 转化条件的优化
• 3.3 小肽SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳
• 3.4 表达条件优化
• 3.5 质粒稳定性
• 第三章 杂合抗菌肽的性质研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 实验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 活性初步测定
• 1.2.2 最小抑菌浓度（MIC）测定
• 1.2.3 效价测定
• 1.2.4 热稳定性检测
• 1.2.5 酸碱稳定性检测
• 1.2.6 抗菌谱测定
• 1.2.7 溶血性体外检测
• 1.2.8 溶血性体内检测
• 2 结果与分析
• 2.1 活性初步测定
• 2.2 最小抑菌浓度（MIC）测定
• 2.3 效价测定
• 2.4 热稳定性检测
• 2.5 酸碱稳定性检测
• 2.6 抗菌谱测定
• 2.7 溶血性体外检测
• 2.8 溶血性体内检测
• 3 讨论
• 3.1 活性与抗菌谱
• 3.2 杂合肽的稳定性
• 3.3 活性与结构的关系
• 3.4 溶血性分析
• 结论
• 参考文献
• 在读期间科研成果
• 致谢
• 综述