论文题目: 三江源国家自然保护区土壤微生物的分子多样性研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物病理学
作者: 张于光
导师: 肖启明,李迪强
关键词: 三江源国家自然保护区,全球变化,土壤微生物,固氮微生物,反硝化细菌
文献来源: 湖南农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 土壤微生物是自然物质循环不可缺少的成员,担负着分解动植物残体的重要作用,直接关系到土壤养分的有效性,对植物生长起到重要的作用,同时微生物在土壤肥力评价和生物净化等方面也有着重要的作用。土壤微生物对环境变化很敏感,能够较早地指示生态系统功能的变化,对于退化生态系统的恢复和治理以及提高不同植被的生产力均有重要的理论和实践意义。 三江源自然保护区是青藏高原的主体部分,是黄河、长江和澜沧江的发源地,平均海拔4400m,孕育了世界上海拔最高、面积最大的高寒草甸和高原湿地。该地区原始自然状态保存较好,是气候、环境变化信息最敏感最完整的载体和自然环境演变过程最忠实的科学记录。由于全球气候变化和人为破坏,“三江源”的生态环境不断恶化,加强三江源地区的生态保护刻不容缓。研究三江源地区的土壤微生物,揭示三江源土壤微生物的生态分布和区域特异性,将为评价三江源地区的生态环境,了解三江源地区土壤微生物在全球变化中的影响,为三江源自然保护区保护策略的制定提供科学依据。 本研究主要通过PCR扩增、基因克隆、RFLP和序列分析对三江源自然保护区不同植被和海拔高度土壤环境中的固氮酶基因nifH、反硝化酶基因nirK与nosZ和16S rDNA的分子多样性进行了分析,同时探讨了不同植被和海拔高度土壤中固氮微生物、反硝化细菌等功能微生物的多样性及其主要影响因子。其主要结果如下: 1、用于分子生态学研究的土壤微生物DNA提取方法研究 土壤微生物分子生态学研究的关键技术之一是从各种环境样品中高效的获得可进行分子生物学研究的基因组DNA。本研究利用SDS高盐法、变性剂加SDS高盐法和溶菌酶加SDS法三种方案对土壤微生物总DNA进行了提取,然后通过电泳加树脂柱回收和连续2次树脂柱回收两种方法进行了纯化,结果表明,变性剂加SDS高盐法的DNA提取效率明显高于其它两种方法,电泳加树脂柱法的纯化效果更好。PCR扩增表明,经过两种纯化方法后得到的DNA,都可以进行16SrDNA扩增和nirK、nosZ、nifH等功能基因的扩增。因此,认为变性剂加SDS高盐法是一种更为高效、可靠和适合于环境微生物分子生态学研究的DNA提取方法。 2、三江源地区土壤固氮微生物的分子多样性研究 为了了解青藏高原地区土壤固氮微生物的群落结构及其差异,本研究首次利用PCR-RFLP和测序分析对位于青藏高原腹地的三江源自然保护区土壤微生物固氮基因(nifH)的多样性和系统发育进行了探讨。研究选取了来自于不同海拔高度、植被类型的6个样品,根据样地的生物地理化学性状的主成分分析(PCA)表明,6个样品可以聚类分为3个不同的组,其中样地YS-2、YS-3、ZD-1和ZD-2较明显的聚类在
论文目录:
第一章 导论
第一节 土壤微生物和氮循环微生物的多样性
1 土壤微生物的多样性及其重要性
2 土壤微生物的固氮作用及固氮微生物的多样性
3 土壤微生物的反硝化作用及反硝化细菌的多样性
4 土壤微生物的硝化作用及其硝化细菌的多样性
5 土壤微生物的氨化作用及氨化细菌的多样性
第二节 环境变化对土壤微生物的影响
1 大气CO_2浓度升高对土壤微生物的影响
2 植被变化对土壤微生物的影响
3 环境污染对土壤微生物的影响
第三节 土壤微生物多样性的研究方法
1 土壤微生物多样性的表示方法
2 传统的微生物培养法
3 PLFA分析法
4 BIOLOG微量分析法
5 核酸杂交分析技术
6 基于PCR的分子生物学方法
6．1 PCR-RFLP分析方法
6．2 PCR-RAPD分析方法
6．3 PCR-SSCP分析方法
6．4 PCR-DGGE分析方法
7 基因芯片技术
第四节 环境微生物分子生态学的研究进展
1 环境微生物DNA的获得
2 环境微生物物种多样性的研究
3 环境微生物种群结构和动力学的研究
4 环境微生物代谢活性的研究
5 前景展望
第五节 本研究的立题背景和技术路线
1 本研究的立题背景和研究意义
2 本研究的主要内容和技术路线
第二章 可用于分子生态学研究的土壤微生物DNA提取方法
1 前言
2 材料和方法
2．1 土壤的采集
2．2 主要试剂
2．3 主要仪器
2．4 DNA的提取方法
2．5 DNA的纯化
2．6 DNA的纯度和定量检测
2．7 DNA的PCR检测
3 结果与分析
3．1 DNA的提取
3．2 DNA的纯化效果
3．3 PCR扩增结果
4 讨论
5 结论
第三章 三江源地区土壤固氮微生物的分子多样性研究
1 前言
2 材料和方法
2．1 材料
2．1．1 土壤样品的采集
2．1．2 主要试剂和仪器
2．2 样品化学性状的测定
2 . 3 DNA的提取和纯化
2．4 固氮基因(nifH)的PCR扩增
2．5 扩增产物的克隆和RFLP分析
2．5．1 扩增产物的回收
2．5．2 nifH片断的克隆
2．5．3 阳性克隆的鉴定
2．5．4 PCR扩增产物的纯化
2．5．5 限制性酶切
2．5．6 8％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳
2．5．7 银染
2．5．8 数据统计
2．6 基因测序和系统发育分析
2．7 统计分析方法
2．8 核苷酸序列登录
3 结果与分析
3．1 主要植被物种
3．2 土壤的生物地理化学性状
3．3 nifH的克隆和RFLP分析
3．4 nifH基因的测序和系统发育分析
4 讨论
4．1 固氮微生物的多样性
4．2 生物地理化学性状与固氮微生物多样性的关系
4．3 植被类型对固氮微生物群落结构和多样性的影响
4．4 海拔高度对固氮微生物群落结构和多样性的影响
4．5 其它环境因子对固氮微生物群落结构和多样性的影响
第四章 三江源地区高寒草甸土反硝化细菌的分子多样性研究
1 前言
2 材料和方法
2．1 材料
2．1．1 样地概况及样品的采集
2．1．2 主要试剂和仪器
2．2 样品化学性状的测定
2．3 DNA的提取和纯化
2．4 nirK和nosZ基因的扩增
2．5 克隆和RFLP分析
2．6 测序和系统发育分析
2．7 统计分析方法
2．8 核苷酸序列登录号
3 结果与分析
3．1 土壤的生物地理化学性状
3．2 nirK和nosZ的克隆和RFLP分析
3．3 nirK和nosZ基因的测序结果和系统发育分析
4 讨论
第五章 三江源地区植被变化对土壤微生物数量和多样性的影响
1 前言
2 材料和方法
2．1 材料
2．1．1 样品概况及样品的采集
2．1．2 主要试剂和仪器
2．2 样品化学性状的测定
2．3 土壤微生物的测定
2．4 土壤DNA的提取和纯化
2．5 16S rDNA的扩增
2．6 克隆和RFLP分析
2．7 测序和系统发育分析
2．8 核苷酸序列登录号
3 结果与分析
3．1 不同样地培养微生物数量分布
3．2 RFLP分析
3．3 测序和系统发育分析
4 讨论
4．1 植被变化对土壤微生物数量的影响
4．2 植被变化对土壤微生物多样性的影响
第六章 主要结论和创新之处
1 主要结论
2 创新之处
3 下一步工作设想
参考文献
附录1 nifH克隆文库核苷酸序列在GenBank中的登录号
附录2 nirK克隆文库核苷酸序列在GenBank中的登录号
附录3 nosZ克隆文库核苷酸序列在GenBank中的登录号
附录4 16S rDNA克隆文库核苷酸序列在GenBank中的登录号
附录5 部分克隆文库测序结果图谱
附录6 三江源国家自然保护区位置图
附录7 三江源国家自然保护区植被分布图
附录8 部分培养基和试剂的配制
论文缩略词表
致谢
作者简历
发布时间: 2005-08-15
参考文献
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- [3].河西走廊干旱气候条件下盐渍土微生物生态研究[D]. 元炳成.兰州大学2007
- [4].基于红树林土壤微生物资源研发的宏基因组学平台技术的建立与应用初探[D]. 蒋云霞.厦门大学2007
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