复方二精灵多糖抗老年痴呆的作用及其机制研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是以认知功能和记忆损害、日常生活能力进行性下降及神经心理症状和精神行为异常为主要临床特征的疾病。其病理特征为细胞外老年斑（senile plaque, SP）中β淀粉样蛋白（Aβ）的沉积、细胞内由成对的过度磷酸化的Tau蛋白组成的神经元纤维缠结（neurofibrilary tangle,NFT）,同时伴有海马和皮层中中枢神经递质乙酰胆碱水平的急剧降低等。随着人口的老龄化,其发病率急剧上升,寻找有效的治疗阿尔茨海默病的药物和治疗方法成为世界范围内的当务之急和研究热点。复方二精灵由等量的枸杞子和黄精组成,最早收载于《圣经总录》具有“助气固精,补填丹田,活血驻颜,长生不老”之功效,枸杞子为茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果实。宁夏枸杞的化学成分主要是枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素及类胡萝卜素酯、维生素C、氨基酸及微量元素等成分。枸杞多糖为其主要活性成分之一,具有免疫调节,抗疲劳、抗衰老,降糖明目,保肝降脂及抗肿瘤等作用。黄精是百合科（Liliaceae）黄精属（Ploygonatum）多种植物的干燥根茎,含有黄精多糖、皂苷、烟酸、醌类、氨基酸及微量元素等成分。黄精多糖是黄精生物学活性物质的一个重要的成分,具有免疫激发、延缓衰老、增强免疫、抗病毒等多种药理作用。本课题组前期通过行为学研究表明复方二精灵多糖（Compound Erjingling polysaccharides,EJL）具有抗AD作用。本文在前期的基础上,运用过量的谷氨酸建立海马神经元损伤模型,研究复方二精灵多糖对海马神经元细胞凋亡的保护作用及分子机理。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中一种兴奋性神经传递氨基酸,释放过量的谷氨酸可导致许多急性或慢性神经病变。采用MTT法,荧光染色形态学观察和流式细胞仪分析复方二精灵提取物对海马神经元细胞凋亡的抑制作用,western blotting检测法及膜片钳电生理方法从分子水平上探讨复方二精灵多糖保护谷氨酸诱导的海马神经元凋亡的机理。MTT检测发现,随着EJL浓度的增加,细胞的存活率也增加;与模型组比较,EJL 2.0及3.0g?L-1的细胞存活率有明显差别（59.6±4.6 vs. 82.8±2.8, 89.4±4.1; n=3, P<0.05）。荧光染色观察形态学变化发现,EJL预处理组凋亡细胞明显减少。FITC-AnnexinV和PI双染,在直方图中可以发现,模型组的凋亡率为32.33%,预处理组则分别为24.33%, 22.01%及12.12%;在PI单染中,预处理组随着EJL给药浓度的增加,sub-G1明显低于模型组。Western blotting结果显示,与模型组比, EJL 2.0g.L-1预处理可以显著提高Bcl-2蛋白表达量,减少Bax蛋白表达量,抑制Caspase-3蛋白降解。全细胞膜片钳结果显示, EJL可以减少谷氨酸受体NMDA激发的内向电流,减少细胞内Ca2+的超载,从而保护海马神经元,由于海马主要功能是参与近期记忆和情感调节,因此EJL具有提高记忆力预防阿尔茨海默病的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 AD 的发病机制
• 1.2 海马神经元细胞凋亡与老年痴呆研究关系
• 1.3 细胞凋亡的检测方法研究现状
• 1.3.1 形态学检测
• 1.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 片段
• 1.3.3 流式细胞仪检测方法
• 1.3.4 ELISA 法
• 1.3.5 线粒体内跨膜电位和膜渗透性变化
• 1.3.6 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）活性的检测
• 1.4 细胞电生理和信号转导
• 1.5 老年痴呆的药物研究进展
• 1.5.1 现代药物研究进展
• 1.5.2 中药防治老年性痴呆研究进展
• 1.6 二精灵化学成分及药理学研究概况
• 1.6.1 枸杞化学成分及药理学研究
• 1.6.2 黄精化学成分及药理学研究
• 1.7 本文研究的目的和主要内容
• 1.7.1 研究目的
• 1.7.2 主要研究内容
• 第2章 复方二精灵多糖对海马神经元细胞凋亡的影响
• 2.1 实验材料、试剂及仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 复方二精灵多糖提取工艺
• 2.2.2 糖含量测定
• 2.2.3 海马神经元体外培养
• 2.2.4 海马神经元的存活率的检测
• 2.2.5 形态学观察
• 2.2.6 流式细胞仪分析
• 2.2.7 Western blot 检测蛋白表达
• 2.2.8 统计学处理
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 复方二精灵对海马神经元存活的影响
• 2.3.2 形态学观察
• 2.3.3 流式细胞仪检测
• 2.3.4 复方二精灵对Bcl-2，Bax 及Caspase-3 表达的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 复方二精灵多糖对海马神经元细胞电生理研究及信号转导
• 3.1 实验材料、试剂及仪器
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 溶液配置
• 3.2.2 全细胞膜片钳记录方法
• 3.2.3 给药方法
• NMDA 的直接影响'>3.2.4 观察EJL 对NMDA 诱发神经元I_NMDA的直接影响
• 3.2.5 统计学处理
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A （攻读学位期间所发表的论文）