表观遗传修饰在HOXB13基因转录中的调控机制及意义

论文摘要

HOXB13作为一个homeodomain蛋白对前列腺癌细胞生长停滞起着重要的作用。它仅仅在AR（androgen receptor）阳性的前列腺细胞中表达,但是,具体的机制未见报道。本文探讨了表观遗传修饰对HOXB13基因转录的影响,并且对其可能的机制和意义做了深入的研究。我们证实了在AR阴性的前列腺癌中组蛋白去乙酰化酶抑制剂NaB能够诱导细胞的生长停滞并且增强HOXB13基因的表达水平。我们的研究表明组蛋白去乙酰化酶HDAC4和转录因子YY1能够在mRNA和蛋白水平上调控HOXB13基因。组蛋白去乙酰化酶HDAC4和转录因子YY1都能够以组蛋白乙酰化的表观修饰机制阻遏HOXB13基因的表达。免疫共沉淀（CoIP）实验表明转录因子YY1和组蛋白去乙酰化酶HDAC4能够存在于同一复合物中。染色质免疫沉淀（ChIP）揭示组蛋白去乙酰化酶HDAC4是由转录因子YY1招募到HOXB13基因启动子处的。启动子截短突变和点突变结果都显示HOXB13基因启动子上两个近端的YY1结合位点对YY1和HDAC4的招募起着重要的作用。MTT细胞增殖检测结果显示YY1和HDAC4能够通过抑制HOXB13基因的表达影响前列腺癌细胞的生长。我们还发现EZH2siRNA和BMI1siRNA通过部分抑制Polycomb复合物亚基EZH2和BMI1的表达进而明显提高了AR阴性的前列腺癌细胞中的HOXB13 mRNA和蛋白表达水平,ChIP分析显示在这个过程中H3K27me3起着重要的作用。DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC能够诱导HOXB13 mRNA和蛋白的表达,亚硫酸氢钠测序（bisulfite genomic sequencing）的研究表明AR阴性的前列腺癌细胞中HOXB13基因启动子处的CpG岛是高甲基化的状态。DNMT3b能够被Polycomb复合物亚基EZH2招募到HOXB13基因启动子处进而抑制HOXB13基因的表达。总之,我们的研究工作阐述了HOXB13基因沉默机制以及其对前列腺癌细胞生长的影响,这些发现也暗示了HOXB13可能作为前列腺癌治疗的一个分子靶标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 一、HOX 基因家族简介
• （一） HOX 家族成员
• （二） HOX 家族蛋白的功能
• （三） HOXB13 基因及其功能研究
• 二、组蛋白乙酰化修饰、DNA 甲基化与真核生物基因的转录调控
• （一） 真核生物的染色质结构与转录调控的关系
• （二） 组蛋白乙酰化修饰与转录调控
• （三） 组蛋白去乙酰化酶
• （四） 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
• （五） DNA 甲基化与基因转录调控
• 三、PCG（POLYCOMB GROUP）蛋白复合物及其功能研究概述
• （一） PcG 蛋白复合物
• 四、本论文研究的内容和意义
• （一） 立题依据
• （二） 本论文的研究内容和意义
• 实验材料与方法
• 一、实验材料
• （一） 质粒
• （二） 蛋白质和抗体
• （三） 哺乳动物细胞系
• （四） 试剂
• 二、实验方法
• Ⅰ. 分子生物学实验方法
• （一） 分子克隆
• （二） DNA 的琼脂糖电泳
• （三） 质粒大量制备的方法
• （四） 哺乳动物细胞总RNA 的提取和反转录
• （五） 染色质免疫沉淀实验（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）
• （六） RNA 干涉（RNAi）
• （七） 亚硫酸氢钠测序（bisulfite genomic sequencing）
• Ⅱ. 细胞生物学实验方法
• （一） 哺乳动物细胞系的培养
• （二） 真核生物细胞的瞬时转染和荧光素酶报告基因检测
• （三） 真核生物细胞系的脂质体和罗氏瞬时转染
• （四） 蛋白质的Western Blot 分析
• （五） 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation assay，CoIP）实验
• （六） MTT 细胞活性检测实验
• 实验结果与分析
• 一、HOXB13 参与组蛋白去酰化酶抑制剂丁酸钠（NAB）诱导的前列腺癌细胞生长抑制
• （一） NaB 抑制了前列腺癌细胞DU145 的生长并且提高了HOXB13 基因的表达水平
• （二） NaB 诱导的前列腺癌细胞生长停滞部分依赖于HOXB13
• 二、组蛋白去乙酰化酶参与调控HOXB13 基因转录的分子机制及意义
• （一） HDAC4 参与HOXB13 基因的表达调控机制及意义
• （二） YY1 参与HOXB13 基因的表达调控机制及意义
• （三） 转录因子YY1 能够与HDAC4 结合并且招募HDAC4 到HOXB13 基因启动子上
• 三、POLYCOMB参与HOXB13 基因的表达调控及机制
• （一） Polycomb 家族蛋白表达与HOXB13 的表达呈现明显的负相关，Polycomb 调控HOXB13 的表达
• （二） Polycomb 通过影响HOXB13 基因启动子上H3K27 三基化的水平调控基因的表达
• 四、DNA 甲基化参与HOXB13 基因的表达调控及机制
• （一） 在前列腺癌细胞DU145 中HOXB13 基因启动子高甲基化
• （二） DNA 甲基转移酶DNMT36 参与HOXB13 基因的调控
• 讨论
• 一、HOXB13 与肿瘤的关系
• 二、HDAC 调控HOXB13 基因转录活性的特异性
• 三、转录因子YY1 在乙酰化修饰调控HOXB13 基因的过程中发挥重要的作用
• 四、PCG 家族蛋白转录调控HOXB13 基因的具体分子机制
• 五、PCG 家族蛋白与前列腺癌的关系
• 主要结论和创新点
• 一、主要结论
• 二、主要创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在学期间公开发表论文及著作情况