冰川细菌的生理特征及16S rRNA基因多样性研究

论文摘要

本研究以青藏高原冰川慕士塔格冰芯和奎屯51号冰川冰雪为介质,通过分离培养,分析了慕士塔格冰芯微生物的生理特征和csp基因克隆;通过流式细胞计数和构建环境样品16S rRNA基因的克隆文库,分析了奎屯冰川冰雪微生物数量和细菌菌群结构的变化特征及其与气候环境的关系。1.从慕士塔格冰芯分离菌株中选取了5个代表菌株,分别对这些菌株的生长温度和酸度范围进行了观测,并利用微生物冷诱导蛋白的保守氨基酸序列,设计了一对冷诱导基因csp的特异引物进行PCR扩增。研究结果表明冰川中存在三种类型的微生物:嗜冷菌生长范围为0℃-23℃,最适生长温度为15℃;耐冷菌生长范围为0℃-40℃,最适生长温度为23℃;宽温菌生长范围为0℃-45℃,最适生长温度为30℃。慕士塔格冰芯菌株对酸度变化的反应不同,说明冰川酸度也是影响微生物冰川表面中的数量分布的一个重要因素。从宽温菌葡萄球菌（Staphylococcus equorum） Muzt-D84中成功地克隆出cspA基因片段,大小为171bp。2.对奎屯冰川冰雪表面微生物活性进行了检测,经流式细胞仪分析表明,细胞活/死为1:5-2:3之间,微生物数量出现了波动性的变化,微生物总数为3.70×104 cell.ml-1到69.50×104 cell.ml-1。这说明微生物是在各种特定的历史时期的不同气候环境条件下,呈事件性地沉降到冰川表面,其中的微生物分布是对不同时期气候环境条件的反映,奎屯冰川表面中相当一部分的微生物是具有活性的。3.通过对奎屯冰川冰雪微生物16S rRNA基因文库及核酸序列的分析,从奎屯冰川冰雪表面中克隆到的88个序列结果表明,所有克隆到的16S rRNA基因序列形成了Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Cytophaga- Flavobactreium- Bacteroides（CFB）、Deinococcus- Thermus、Chloroflexi、Firmicutes和Eukaryotic chloroplast,以Proteobacteria含量最高,占到总数的57%,其次是CFB组,占总数的23.7%,Cyanobacteria占总数的7%,Actinobacteria占总数的2.48%,其他类占总数的3.55%。这些克隆序列分属于Deinococcus、Variovorax、Microcoleus、Polyangium、Phormidium、Bradyrhizobium、Thiobacillus、Polaromonas、Sphingomonas、Hymenobacter、Panaciterramonas、Arthrobacter、Leifsonia、Janthinobacterium、Halobacillus、Hymenobacter、Pedobacter、Leptolyngbya、Limnothrix、、Flectobacillus、Flavobacterium、Microcoleus属以及其它种类,共31个属,9个为未鉴定的属,其中Panaciterramonasax和Variovorax属是整个菌群中的优势属。微生物菌群结构随海拔高度的变化具有明显的的分布特征,海拔越高,微生物群落种类越少,不同的冰或雪环境中分布着特定类群的微生物。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 冰川微生物的研究状况
• 1.1 南极环境微生物的研究
• 1.2 其它大陆高山冰川微生物的研究
• 2 冰川微生物分布的影响因素
• 2.1 气候
• 2.2 其它生物
• 2.3 微生物适应能力
• 2.4 海拔高度
• 2.5 矿物含量
• 3 微生物活性物质
• 3.1 抗冻物质
• 3.2 多不饱和脂肪酸
• 3.3 抗紫外辐射物质
• 3.4 抗菌、抗肿瘤物质
• 3.5 低温酶
• 3.6 冷休克蛋白
• 4 冰川环境
• 4.1 冰芯矿物组成结构
• 4.2 冰川温度和pH 值
• 5 微生物的来源
• 6 冰川微生物研究方法
• 6.1 冰芯中微生物量的测定方法
• 6.2 传统培养和分离方法
• 6.3 分子生物学技术在环境科学领域中的应用
• 6.3.1 总 DNA 中 MOL %G+ C 丰度分析
• 6.3.2 16S RRNA 基因克隆技术
• 6.3.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）图谱
• 6.3.4 核酸杂交法
• 6.3.5 随机引物扩增多态性方法
• 6.3.6 RFLP 谱图分析
• 7 研究区域
• 7.1 冰芯样品的采集地点概况
• 7.2 奎屯河51 号冰川概况
• 第二章 慕士塔格冰芯细菌的生理特征以及葡萄球菌MUZT-D84 CSPA 基因序列分析..
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 菌株的活化及悬浮液的制备
• 1.2.2 温度对菌株生长的影响
• 1.2.3 PH 对菌株生长的影响
• 1.2.4 基因组 DNA 的提取和 CSP基因的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 温度对冰川细菌生长的影响
• 2.2 pH 值对冰川细菌的生长的影响
• 2.3 Muzt-D84 菌株DNA 的扩增
• 2.4 Muzt-D84 csp DNA 序列分析
• 3 结论与讨论
• 第三章 奎屯冰川冰雪微生物生存能力评估与环境因子的关系
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 冰川样品的采集
• 1.1.2 供试试剂和器材
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞着色的检测
• 1.2.2 细胞生存能力的检测
• 1.2.3 微生物数量的检测
• 1.2.4 流式细胞检测
• 1.2.5 细胞总数的计算
• 1.2.6 冰川冰雪微生物数量与环境因子的关系
• 2 结果与分析
• 2.1 细胞着色的测定
• 2.2 细胞分类
• 2.3 细胞丰度
• 2.4 微生物细胞的死/活比例
• 2.5 冰川冰雪微生物数量与环境因子的关系
• 2.5.1 冰雪微生物数量及死/活比随深度的变化
• 2.5.2 微生物数量随海拔的变化
• 2.5.3 微生物与污化物的关系
• 3 结论与讨论
• 第四章 奎屯冰川表面细菌菌群结构
• 1 材料与方法
• 1.1 冰川样品的采集和预处理
• 1.2 冰川总 DNA 提取
• 1.2.1 DNA 提取方法
• 1.2.2 DNA 纯度、质量检测
• 1.2.3 提取 DNA 的 PCR 扩增检测
• 1.2.4 165 RNA 扩增片段的基因克隆
• 1.2.5 测定序列与网上数据库对比分析以及系统发育树构建
• 2 结果与分析
• 2.1 冰川 DNA 的提取
• 2.2 冰川DNA 中165 rRNA 基因的 PCR 扩增
• 2.3 冰川冰雪表面细菌165 rRNA 基因的克隆和ARDRA 分析
• 2.4 奎屯冰川冰雪表面微生物的系统发育分析
• 2.4.1 奎屯冰川冰雪表面样品克隆序列和南北极及其他冰川细菌的同源性
• 2.4.2 奎屯冰川冰雪表面样品克隆序列与土壤和湖水细菌的同源性
• 2.4.3 奎屯冰川冰雪表面样品克隆序列与其他真核细菌的同源性
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 3.2.1 冰川表面细菌类群的空间分布特征
• 3.2.2 Β-PROTEOBACTERIA 和 CFB 组不同海拔高度的种类分布
• 3.2.3 其他细菌在奎屯表面的分布
• 主要结论
• 附录 冰雪样品中克隆的165 RRNA 基因的部分序列结果
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介